一种间充质干细胞注射液及其制备方法和应用与流程

本发明涉及干细胞
技术领域：
，特别涉及一种间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。
背景技术：
：帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)，也称帕金森氏病，是一种常见的以纹状体多巴胺能神经元功能进行性丧失为特征的神经系统变性疾病。1817年英国医生JamesParkinson首先对此病进行了详细的描述，其临床表现主要包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍，同时患者可伴有抑郁、便秘和睡眠障碍等非运动症状。我国65岁以上人群PD的患病率大约是1.7％。大部分帕金森病患者为散发病例，仅有不到10％的患者有家族史。帕金森病确切的病因至今未明确，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与PD多巴胺能神经元的变性死亡过程。其突出的病理改变是中脑黑质多巴胺(DA)神经元变性、缺失导致纹状体内多巴胺水平下降以及黑质残存神经元胞质内出现嗜酸性包涵体，即路易小体(Lewybody)。出现临床症状时，黑质多巴胺能神经元死亡至少在50％以上，纹状体DA含量减少在80％以上。除多巴胺能系统外，帕金森病患者的非多巴胺能系统也有明显的受损，如Meynert基底核的胆碱能神经元，蓝斑的去甲肾上腺素能神经元，脑干中缝核的5-羟色胺能神经元，以及大脑皮质、脑干、脊髓以及外周自主神经系统的神经元。大量临床及动物实验研究发现，基底神经节中出现的异常β波还与PD的肌张力密切相关。目前治疗PD主要是采用药物治疗，但化学药物具有一定的副作用，随着生物技术的发展，干细胞在治疗各种疾病模型中的研究愈来愈多，由于它具有自我更新并可分化成多种类型的细胞，有着广泛的应用前景，因此也被作为治疗神经退行性疾病的主要研究对象。观察帕金森病动物模型的行为成为帕金森病动物模型和药物验证的重要手段。目前主要是采用骨髓间充质干细胞进行治疗的研究，但骨髓采集会给患者带来身体上的痛苦。胎盘间充质干细胞等干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、残留低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备且成本低等特征，以上生物学特性使其有可能成为用于组织修复、抑制免疫排斥反应的发生和代谢性疾病细胞治疗最具临床应用前景的多能干细胞。因此，提供一种能够有效治疗帕金森病的干细胞制剂具有重要的医学价值。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。该间充质干细胞注射液能有效的维持干细胞的活力，能够提高纹状体多巴胺含量，可有效治疗帕金森病。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种间充质干细胞注射液，包括间充质干细胞、人血白蛋白、低分子肝素钙、维生素C、香菇多糖、二甲基亚砜和溶媒。在本发明中，人血白蛋白为临床注射级成分，为细胞提供营养；维生素C可维持过氧化物酶的活性，从而保持细胞的活性；低分子肝素钙能有效减少细胞结团，防止细胞输注时堵塞输液过滤器并减少细胞损失；DMSO为临床级别；溶媒可保持细胞的渗透压，利于细胞保持活性。本发明将几种物质组合使用后可以更好地维持间充质干细胞的活力，从而具有更好的疗效。作为优选，每100mL间充质干细胞注射液中包括：间充质干细胞：(0.5～l)×108个；人血白蛋白：1～5g；低分子肝素钙：0.5g；维生素C：0.3～0.7g；香菇多糖：0.2～0.6g；二甲基亚砜：5～9mL；溶媒：补足。优选地，每100mL间充质干细胞注射液中包括：间充质干细胞：1×108个；人血白蛋白：1～5g；低分子肝素钙：0.5g；维生素C：0.3～0.7g；香菇多糖：0.2～0.6g；二甲基亚砜：5～9mL；溶媒：补足。在本发明提供的实施例中，每100mL间充质干细胞注射液中包括：间充质干细胞：1×108个；人血白蛋白：3g；低分子肝素钙：0.5g；维生素C：0.5g；香菇多糖：0.4g；二甲基亚砜：7mL；溶媒：补足。在本发明提供的另一实施例中，每100mL间充质干细胞注射液中包括：间充质干细胞：1×108个；人血白蛋白：1g；低分子肝素钙：0.5g；维生素C：0.3g；香菇多糖：0.2g；二甲基亚砜：5mL；溶媒：补足。在本发明提供的另一实施例中，每100mL间充质干细胞注射液中包括：间充质干细胞：1×108个；人血白蛋白：5g；低分子肝素钙：0.5g；维生素C：0.7g；香菇多糖：0.6g；二甲基亚砜：9mL；溶媒：补足。作为优选，间充质干细胞为胎盘间充质干细胞。作为优选，胎盘间充质干细胞为第2～5代胎盘间充质干细胞。在本发明提供的实施例中，胎盘间充质干细胞为第3代胎盘间充质干细胞。作为优选，溶媒为复方电解质注射液、葡萄糖注射液或生理盐水。临床输注以复方电解质注射液为最佳。作为优选，复方电解质注射液为勃脉力A复方电解质注射液。在本发明提供的实施例中，生理盐水为0.9％氯化钠注射液。本发明还提供了该间充质干细胞注射液在制备提高纹状体多巴胺含量的药物或治疗帕金森病的药物中的应用。本发明还提供了该间充质干细胞注射液的制备方法，包括：将人血白蛋白、低分子肝素钙、维生素C、香菇多糖和溶媒混匀，过滤除菌，再加入二甲基亚砜，预冷，得到混合液；采用混合液重悬间充质干细胞，得到间充质干细胞注射液。作为优选，过滤除菌采用除菌级亲水性过滤器过滤除菌。作为优选，除菌级亲水性过滤器的孔径为0.1～1μm。作为优选，预冷的温度为4℃。本发明提供了一种间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。该间充质干细胞注射液包括间充质干细胞、人血白蛋白、低分子肝素钙、维生素C、香菇多糖、二甲基亚砜和溶媒。本发明具有如下有益效果：1、本发明采用胎盘间充质干细胞制备干细胞注射液，取材方便，不违反伦理问题；2、本发明制备的间充质干细胞注射液能有效的维持干细胞的活力，在低温状态下冻存48个月干细胞活率，使用方便；3、本发明的间充质干细胞注射液能够提高纹状体多巴胺含量，可有效治疗帕金森病。附图说明图1示胎盘间充质干细胞的鉴定结果；其中1-1示P3代细胞培养72h后在显微镜下放大40倍的图片；1-2示P3代细胞培养72h后在显微镜下放大100倍的图片；图2示胎盘间充质干细胞的染色鉴定结果；2-1示P3代胎盘间充质干细胞诱导分化为成骨细胞后在显微镜下放大40倍的图片；2-2示P3代胎盘间充质干细胞诱导分化为成骨细胞后在显微镜下放大100倍的图片；2-3示P3代胎盘间充质干细胞诱导分化为成脂细胞后在显微镜下放大40倍的图片；2-4示P3代胎盘间充质干细胞诱导分化为成脂细胞后在显微镜下放大100倍的图片。具体实施方式本发明公开了一种间充质干细胞注射液及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为胰岛、神经、血管内皮、骨、软骨、肌肉、肝脏、心肌等多种组织细胞。本发明提供的间充质干细胞注射液及其制备方法和应用中所用原料药或辅料均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1胎盘间充质干细胞的制备1、胎盘间充质干细胞原代分离在无菌条件下，取产后弃置的新鲜胎盘，剥离胎盘，用PBS缓冲溶液冲洗，将胎盘组织剪成5×5cm2，加入3-5倍体积的0.25％胰酶消化，置于200r/min37℃恒温摇床上，消化30min，每隔10min剧烈摇晃数次，以去除上皮细胞。消化完成后，将其转移至储液瓶中，加入150mLPBS缓冲溶液，剧烈摇动，重复此操作2次。将胎盘组织转移至小烧杯中，剪碎至1mm3。再转移至储液瓶中，加入20mL0.5％I型胶原酶以及完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)，使胶原酶终浓度为0.1-0.2％。置于37℃，250r/min的恒温摇床中，直到组织块基本融化。用PBS缓冲溶液稀释消化后的组织液，1500r/min，离心5min，弃掉上清，用PBS缓冲溶液重悬沉淀，采用100μm过滤筛网过滤，滤液1500r/min，离心5min，获得胎盘间充质干细胞。用完全培养基重悬，按0.3-1×106cells/mL接种接种于10cm培养皿中，每皿添加100μL1μg/mLEGF和终浓度为100ng/mL的SHH。置于CO2培养箱中培养，48h后换液，后续每2～3d换一次培养基。2、人胎盘间充质干细胞传代培养待原代人胎盘间充质干细胞生长至80％融合时，即用0.25％的EDTA-Trypsin消化，进行传代培养，传至2-5代后，观察细胞生长状态，用胰酶消化后使用PBS缓冲溶液洗涤，离心收集。3、鉴定制备的2-5代胎盘间充质干细胞，包括显微镜下观察、流式检测和染色观察，鉴定结果参照“国际细胞治疗协会(ISCT)”所定制的标准，结果如下：1)显微镜下观察由图1可以看出培养3d后的第3代胎盘间充质干细胞已经形成较典型的胎盘间充质样，并有明显的贴壁现象。2)流式检测取第3代的胎盘间充质干细胞进行流式细胞仪检测。由表1可以看出，该细胞表达CD105、CD73、CD90和HLA-ABC(表达量高于90％)，不表达CD45、CD34和HLA-DR(表达量于1％)。表1胎盘间充质干细胞的流式检测结果标记抗体阳性比率(％)标记抗体阳性比率(％)CD340.06CD10599.15CD9099.89HLA-ABC99.23CD450.13HLA-DR0.42CD7397.8//3)染色观察取第3代的胎盘间充质干细胞进行体外诱导分化为成脂肪细胞和成骨细胞，染色观察。由图2可以看出本发明制备的胎盘间充质干细胞经过适宜条件可向成脂肪细胞和成骨细胞分化，证明本发明制备的胎盘间充质干细胞具有多向分化能力。结论：上述试验结果可以证明本发明所制备的细胞具备间充质干细胞的特性。实施例2胎盘间充质干细胞制剂的制备配制100mL干细胞注射液的方法：将白蛋白浓度为10％的人血白蛋白原液30mL(质量体积比终浓度为3％)、低分子肝素钙0.5mL(质量体积比终浓度为0.5％)、维生素C0.5g(质量体积比终浓度为0.5％)、香菇多糖0.4g(质量体积比终浓度为0.4％)和0.9％氯化钠注射液61.6mL混匀，缓慢加入DMSO7mL(体积百分含量为7％)，放入4℃冰箱中预冷，将胎盘间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬，将制备的胎盘间充质干细胞注射液分装于细胞冻存袋中，制备完毕。实施例3胎盘间充质干细胞制剂的制备配制100mL干细胞注射液的方法：将白蛋白浓度为20％的人血白蛋白原液5mL(质量体积比终浓度为1％)、低分子肝素钙0.5mL(质量体积比终浓度为0.5％)、维生素C0.3g(质量体积比终浓度为0.3％)、香菇多糖0.2g(质量体积比终浓度为0.2％)和0.9％氯化钠注射液88.8mL混匀，缓慢加入DMSO5mL(体积百分含量为5％)，放入4℃冰箱中预冷，将胎盘间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬，将制备的胎盘间充质干细胞注射液分装于细胞冻存袋中，制备完毕。实施例4胎盘间充质干细胞制剂的制备配制100mL干细胞注射液的方法：将白蛋白浓度为20％的人血白蛋白原液25mL(质量体积比终浓度为5％)、低分子肝素钙0.5mL(质量体积比终浓度为0.5％)、维生素C0.7g(质量体积比终浓度为0.7％)、香菇多糖0.6g(质量体积比终浓度为0.6％)和勃脉力64.4mL混匀，缓慢加入DMSO9mL(体积百分含量为9％)，放入4℃冰箱中预冷，将胎盘间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬，将制备的胎盘间充质干细胞注射液分装于细胞冻存袋中，制备完毕。实施例5胎盘间充质干细胞注射液的常规检测上述实施例2-4制备的胎盘间充质干细胞注射液均应留样进行内毒素检测、细菌真菌检测、支原体检测，检测结果均为阴性为合格。实施例6胎盘间充质干细胞注射液的功能鉴定(1)试验分组：试验组1：实施例2制备的胎盘间充质干细胞注射液；试验组2：实施例3制备的胎盘间充质干细胞注射液；试验组3：实施例4制备的胎盘间充质干细胞注射液；对照组1：对照组1与实施例2基本相同，只是不添加维生素C，其制备方法为：将白蛋白浓度为10％的人血白蛋白原液60mL(质量体积比终浓度为6％)、低分子肝素钙1mL(质量体积比终浓度为1％)、香菇多糖0.8g(质量体积比终浓度为0.8％)和0.9％氯化钠注射液25mL混匀，缓慢加入DMSO14mL(体积百分含量为14％)，放入4℃冰箱中预冷，将胎盘间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬，将制备的胎盘间充质干细胞注射液分装于细胞冻存袋中，制备完毕。对照组2：对照组2与实施例2基本相同，只是不添加维生素C和香菇多糖，其制备方法为：将白蛋白浓度为10％的人血白蛋白原液30mL(质量体积比终浓度为3％)、低分子肝素钙0.5mL(质量体积比终浓度为0.5％)和0.9％氯化钠注射液662.5mL混匀，缓慢加入DMSO7mL(体积百分含量为7％)，放入4℃冰箱中预冷，将胎盘间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬，将制备的胎盘间充质干细胞注射液分装于细胞冻存袋中，制备完毕。对照组3：对照组3注射液中只添加维生素C，其制备方法为：将维生素C1g(质量体积比终浓度为1％)和0.9％氯化钠注射液93mL混匀，缓慢加入DMSO7mL(体积百分含量为7％)，放入4℃冰箱中预冷，将胎盘间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬，将制备的胎盘间充质干细胞注射液分装于细胞冻存袋中，制备完毕。(2)试验方法及结果1)冻存试验将实施例2-4的胎盘间充质干细胞注射液和对照组1-4制备的间充质干细胞注射液经程序降温仪降温，再放入液氮中保存。从液氮中取出以上几种冻存配方的细胞冻存袋，进行37℃水浴锅中复苏，2min内完成复苏过程，取少量复苏后的细胞悬液进行台盼蓝染色计数，同样方法分别测定冻存6个月、12个月、24个月和48个月的细胞活率，结果如表2所示：表2各试验组细胞活率检测结果冻存时间实施例2实施例3实施例46个月98.7％±0.4％98.7％±0.4％98.7％±0.4％12个月95.8％±0.2％95.5％±0.1％96.6％±0.2％24个月91.1％±0.3％90.1％±0.3％91.8％±0.4％48个月87.8％±0.2％87.2％±0.1％89.6％±0.3％表3各对照组细胞活率检测结果冻存时间对照组1对照组2对照组36个月98.7％±0.4％98.7％±0.4％98.7％±0.4％12个月90.1％±0.3％85.1％±0.1％80.1％±0.3％24个月86.4％±0.1％80.3％±0.2％68.3％±0.2％48个月70.6％+0.2％68.7％±0.4％55.7％±0.3％从表2、3可以看出，本发明的胎盘间充质干细胞注射液经过长时间保存后复苏，其活力依旧较高，并且达到国家要求的一般细胞治疗活率大于等于85％，并且细胞活率经过48个月的冻存复苏后活率均高于对比例1-4。2)分化培养试验将实施例2注射液冻存48个月后复苏的细胞进行无血清间充质干细胞培养基培养，观察细胞形态，向成脂、成软骨和成骨分化，经染色在显微镜下观察均成阳性，证明其依旧保持多向分化能力。3)流式检测将实施例2注射液冻存48个月后复苏的细胞进行流式检测，检测结果如下表：表4胎盘间充质干细胞复苏后流式检测结果标记抗体阳性比率(％)标记抗体阳性比率(％)CD340.08CD10598.87CD9099.74HLA-ABC98.62CD450.31HLA-DR0.63CD7396.8//从以上流式结果可以看出经过冻存24个月的胎盘间充质干细胞与新鲜制备的间充质干细胞表型一致，证明本发明制备的胎盘间充质干细胞长期保存对细胞表型及干性无影响。实施例7胎盘间充质干细胞注射液对治疗小鼠帕金森病的实验效果(一)PD模型的鉴定：购买60只PD模型大鼠，模型建立后1周开始，用0.5mg/kg阿扑吗啡腹腔注射诱导其向健侧旋转，记录大鼠旋转次数，每次测定持续40分钟，每周1次，凡旋转次数超过7次/min以上，即为成功模型。购买PD模型均为成功模型。(二)MSCs的治疗：将60只PD模型大鼠随机分为3组，每组20只，分别为A、B、C三组：A组：为空白对照；B组：为生理盐水组；C组：本发明实施例2胎盘间充质干细胞制剂移植组；用CM-Dil标记细胞：将本发明的干细胞制剂组合物取200ul细胞悬液，加入1ulCM-Dil荧光染料，37℃避光孵育5min，然后4℃避光孵育15min，用生理盐水洗涤两次，置于荧光显微镜下观察，PD模型大鼠用10％水合氯醛(0.2mL/100g)腹腔注射麻醉，常规消毒，固定于脑立体定位仪上，保持前后水平，移植注射部位与造模注射部位一致。移植细胞数量为：A组空白对照，即不做任何处理、B组注射10ul等体积生理盐水、C组原位移植MSCs，1×106个/10ul。3组均缝合切口，每日正常喂养清洁。治疗效果的检测方法通常采用行为学观察、免疫组化检测，具体试验方法如下：(1)行为学观察1)移植MSCs后，各组PD大鼠每周定时腹腔注射阿扑吗啡(0.5mg/kg)诱导PD样症状，约10min待大鼠旋转稳定后，摄像记录5min内大鼠旋转次数，连续诱导，观察4周。2)第2周，C组(MSCs移植组)于移植2周后，PD大鼠的旋转次数开始减少，连续移植后第4周，旋转次数明显少于A组(空白对照组)(P＜0.05)，PD大鼠的旋转行为得到较为显著的改善。B组于移植后第2周开始直到第8周(观察期末)旋转次数与对照组无明显变化。3)PD大鼠细胞移植后其旋转圈数由移植前的12～15圈/min降至3～6圈/min。(2)免疫组化检测TH的表达1)灌注固定对照组及细胞移植组PD大鼠后，取脑组织制备冰冻切片做TH免疫组织化学染色，观察大鼠脑黑质多巴胺细胞的损毁情况；并在荧光显微镜下观察CM-Dil标记的移植细胞在脑内的存活和生长情况。2)TH免疫免疫组织化学结果：对照组PD大鼠损毁侧黑质的TH免疫阳性细胞较少，细胞移植术后4周，可以看到损毁侧黑质散在的TH免疫阳性细胞，胞体呈现椭圆形或椎体状。3)ELISA检测PD大鼠脑纹状体多巴胺含量，细胞移植后4w，TLISA法检测各组大鼠大脑纹状体多巴胺含量，各组含量分别如表5所示：表5各组大鼠大脑纹状体多巴胺含量检测结果由表5可以看出，C组经过细胞移植4周后PD大鼠的纹状体多巴胺含量明显高于其他两组。可见，本发明的胎盘间充质干细胞组合物能有效治疗帕金森病。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3