原发性肝癌磁共振双靶点特异性分子探针及其制备方法与流程

本发明属于医疗及分子影像学技术领域，具体地说，本发明涉及一种原发性肝癌磁共振(MR)双靶点特异性分子探针及其制备方法。

背景技术：

磁共振检查具有软组织分辨率高、无电离辐射，能够提供多参数、多对比度图像等特点，已经成为肝脏占位病变临床影像学检查最重要的检查方法。但是，目前使用的或用于临床前期研究原发肝癌MR特异性分子探针均为甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)或磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC3)单分子靶点的分子探针，这些单靶点特异性分子探针存在检测灵敏度低，对于AFP或 GPC3低表达得原发性肝癌就无法检测到，更是无法检测到小的肝癌病灶。

原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是多种因素造成的多基因累积、多步骤和多阶段的过程，属于一种多基因复杂性状疾病。在其发生和发展过程涉及到不同的基因和不同表达形式。所以，单靶点的分子探针无法提高探测的灵敏度，致使无法检测到小的病灶，特别是肝癌微血管侵犯(microvascular invasion,MVI)病灶。肝细胞肝癌小病灶和MVI检出对于肝细胞肝癌治疗效果至关重要。

AFP和GPC3在原发性肝癌肝细胞呈现出高表达，但是有些肝癌细胞AFP 表达并不高，有文献报道在AFP低表达的肝癌细胞GPC3呈现高的表达。AFP 和GPC3在原发性肝癌检出中具有很好的互补性，原发性肝癌诊疗规范(2017 年版)也将这两个生物标志物纳入诊疗规范中。

为了解决检测小的肝癌病灶和提高对MVI检出率。我们先前工作的基础上，制备出原发性肝癌MR双靶点(AFP和GPC3)特异性分子探针。

技术实现要素：

针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种对原发性肝癌MR双靶点特异性分子探针及其制备方法。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种原发性肝癌MR双靶点特异性分子探针，包括载体，所述载体末端分别连接有两种能够与原发肝癌细胞特异性结合抗体：Anti-AFP和Anti-GPC3。

其中，所述载体为MR非特异性对比剂，所述载体选自超顺磁性氧化铁 (SPIO)或超小超顺磁性氧化铁(USPIO)。对所述载体末端修饰后增加羧基，通过所述羧基分别连接Anti-AFP和Anti-GPC3。

进一步的，Anti-AFP与所述载体连接的分子数量多于Anti-GPC3与所述载体连接的分子数量，Anti-AFP与Anti-GPC3优选比例为3：2或3：1。

本发明提供一种原发性肝癌MR双靶点特异性分子探针，其分子结构如下所示：

本发明还提供一种原发性肝癌MR双靶点特异性分子探针的制备方法，采用一锅法制备，具体包括以下步骤：

S1选择载体，所述载体为超顺磁性氧化铁SPIO或超小超顺磁性氧化铁 USPIO，对其末端修饰后增加羧基；

S2利用羧基连接两个能够与原发肝癌细胞特异性结合抗体：Anti-AFP和 Anti-GPC3；

S3采用离心机离心方法或磁性分离方法分离最后产物。

进一步的，Anti-AFP与所述载体结合分子数量多于Anti-GPC3与所述载体结合分子数量。

优选的，Anti-AFP与所述载体结合分子数量和Anti-GPC3与所述载体结合分子数量的比例为3:2或3:1。

本发明的有益效果：在一个分子探针上连接连个双靶点特异性抗体，可以显著提高对肝癌病灶，以及MVI检出率。同时也便于对原发性肝癌体外和活体分子成像研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1和图2是根据本发明实施例的一种原发肝癌双靶点USPIO纳米载体双靶点特异性分子探针分子结构；

图3和图4是两种羧基末端修饰的载体与Anti-AFP-NH2/Anti-GPC3-NH2的酰胺反应式；

图5是三种特异性肝癌MR分子探针与人肝癌细胞BEL-7402结合图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

基于纳米USPIO或SPIO为载体，对其末端修饰后增加羧基。

采用一锅法，将N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(N-ethyl-N’- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDC)1mg和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)2mg溶解到0.5mL磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)中，PH＝7.4。将缓冲液PH调至5.0。加入末端修饰后带有羧基USPIO 或SPIO 1ml或5mg后反应3小时；然后，加入磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican 3,GPC3)抗体(anti-GPC3)反应1小时后，加入甲胎蛋白(Alpha-Fetoprotein,AFP) 抗体(anti-AFP)再继续反应3小时。将反应液中的PH值调至7.0。然后再反应30分钟。反应过程进行缓慢搅拌。将反应液离心(5000rpm/min,5min)分离探针。或采用磁性分离技术分离探针。

本发明实施例所有试剂均从Sigma-Aldrich公司购得，SPIO或USPIO的比重均为2.6g/cm³，SPIO的颗粒大小大于50nm，USPIO的颗粒大小小于50nm。质量控制：直接用电镜检测，流式细胞鉴定或荧光显微镜。

在EDC/NHS的活化作用下，Anti-AFP/Anti-GPC3与纳米分子或MR对比剂连接化学反应式如下式1和式2，其中，式1中，Anti-AFP与所述载体结合分子数量与Anti-GPC3与所述载体结合分子数量比例为3：2(图1)；式2中，Anti-AFP 与所述载体结合分子数量与Anti-GPC3与所述载体结合分子数量比例为3：1(图 2)。

测量T1/T2(USPIO 0.125mg)

图5所示，是三种特异性肝癌MR分子探针(USPIO-antiAFP， USPIO-antiGPC3及antiAFP-USPIO-antiGPC3与人肝癌细胞BEL-7402结合图，表明双靶点分子探针(antiAFP-USPIO-antiGPC3)明显提高细胞摄取率，半定量计算累积光密度值提高25％以上。