(沈QIDN0:2);
[0036]下游引物序列sh化oB-P2 :5'-AAAACGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTA CTGAACACG-3'(沈QIDN0:3)。
[0037] 本发明中还提供表达所述祀向性沉默化oB的shRNA序列的shRNA慢病毒载体。进 一步地，所述shRNA慢病毒载体中包括采用上述引物序列退火合成得到的shRNA序列。
[003引本发明中还提供所述祀向性沉默化oB的shRNA慢病毒载体的构建方法，包括W下 步骤：
[0039] (1)构建载体骨架pLVX-EFl-copGFP-Puro:
[0040]WpCDFl-MCS2-EFl-copGFP(SBI公司）载体为模板，PCR扩增得到EFl-copGFP片 段（引物序列见表1)，用Mlul和Afel双酶切PCR产物，插入到同样经过Mlul和Afel双酶切 的慢病毒载体pLVX-Puro(Clontech公司）上，得到载体骨架pLVX-EFl-copGFP-PGK-Puro。
[0041] 表1用于扩增EFl-copGFP的寡核巧酸引物
[0042]
[0043] 似插入启动子U6:
[0044] 用Clal和化〇1双酶切步骤（1)得到的载体pLVX-EFl-copGFP-PGK-Puro,去憐酸 后电泳回收；用Clal和化〇1双酶切U6启动子的PCR产物后（引物序列见表2)，与载体 pLVX-EFl-copGFP-Puro连接，转入大肠杆菌感受态细胞中，涂LB-Amp平板，培养过夜，鉴定 后得到的载体为pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro。
[0045] 表2用于扩增U6启动子的寡核巧酸引物
[0046]
[0047] (3)插入CC地序列得到shRNA慢病毒载体： W48]WpLenti6载体化vitrogen公司）为模板，PCR扩增大肠杆菌CC地致死基因的 片段，在CC地两端分别引入BsmBI酶切位点，将扩增的到的CC地用化〇1和MluI双酶切 后，与经过化〇1和MluI双酶切的pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro载体连接，转入大肠杆 菌感受态细胞中，涂LB-Amp-化1平板，培养过夜，进行菌落PCR及酶切鉴定，得到用于表达 shlihoB的shRNA慢病毒载体PLVX-U6-CC地-EFl-copGFP-PGK-Puro。 W例 （4)构建用于祀向性沉默sh化oB的shRNA慢病毒载体
[0050] 采用引物退火合成所述shRNA序列；其中，上游引物序列sh化oB-Pl: 5'-ACCGCGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3' ；下游引物 序列shRhoB-P2:5'-AAAACGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAAC ACG-3'。用BsmBI单酶切shRNA慢病毒载体pLVX-Ue-cc地-EFl-copGFP-PGK-Pur 0,得到pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro载体骨架，将退火合成的shlihoB序列与 pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro载体骨架通过相应的酶切位点连接，转入大肠杆菌感受态 细胞St油le3,涂LB-Amp平板37°C培养过夜，挑取单克隆进行测序，构建得到用于祀向性沉 默化oB的shRNA慢病毒载体pLVX-U6-shI?hoB-EFl-copGFP-PGK-Puro。
[0051] 本发明中还提供所述祀向性沉默化oB的shRNA序列的应用，将所述shRNA序列用 于制备抑制化oB基因表达的生物制剂。由于所述shRNA序列可通过抑制化〇/化〇激酶信 号通路的异常活化，可用于制备肺动脉高压等疾病的药物。
[0052] W下通过实施例对本发明作进一步说明。
[0053] 本发明实施例中所用的实验材料来源见表3所示。
[0054] 表3实验材料及来源 阳化引
[0056] 实施例1 :构建用于表达shRNA的慢病毒骨架载体
[0057] (1)构建载体骨架pLVX-EFl-copGFP-Puro:
[0058]WpCDFl-MCS2-EFl-copGFP(SBI公司）载体为模板，PCR扩增得到EFl-copGFP片 段（引物序列见表1)，用Mlul和Afel双酶切PCR产物，插入到同样经过Mlul和Afel双酶切 的慢病毒载体pLVX-Puro(Clontech公司）上，得到载体骨架pLVX-EFl-copGFP-PGK-Puro。
[0059] 似插入启动子U6:
[0060] 用Clal和化〇1双酶切步骤（1)得到的载体pLVX-EFl-copGFP-PGK-Puro,去憐酸 后电泳回收；用Clal和化〇1双酶切U6启动子的PCR产物后（引物序列见表2)，与载体 pLVX-EFl-copGFP-Puro连接，转入大肠杆菌感受态细胞中，涂LB-Amp平板，培养过夜，鉴定 后得到的载体为pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro。
[0061] (3)插入CC地序列得到shRNA慢病毒载体：
[00创 WpLenti6载体化vitrogen公司）为模板，PCR扩增大肠杆菌CC地致死基因， 在CC地两端分别引入BsmBI酶切位点，将扩增的到的CC地用化01和MluI双酶切后，与 经过化01和MluI双酶切的pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro载体连接，转入大肠杆菌感受 态细胞中，涂LB-Amp-化1平板，培养过夜，进行菌落PCR及酶切鉴定，得到用于表达sh化oB 的shRNA慢病毒载体pLVX-Ue-cc地-EFl-copGFP-PGK-Puro。
[0063] 实施例2 :针对化oB基因设计siRNA和shRNA序列 W64] 本实施例首先针对基因化oB(GeneID:338)设计siRNA序列，并合成相应的shRNA 寡核巧酸引物，引物序列如表4所示。 W65] 表4用于退火合成sh化oB序列的寡核巧酸引物
[0066]
[0067] 按照表5的体系进行加样并混合，均匀混合后，置于沸水中，静置待其降至室溫 (4-6h)。
[0068] 表5sh化oB引物形成双链的退火体系
[0069]
[0070] 实施例3 :构建祀向性沉默化oB基因的shRNA慢病毒载体 阳〇7U用BsmBI单酶切实施例1中构建的shRNA慢病毒载体PLVX-U6-CC地 -EFl-copGFP-PGK-Puro,切胶回收后，将实施例1中退火合成的sh化oB双链与 pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro载体骨架通过相应的酶切位点连接，转入大肠杆菌感受态 细胞St油le3,涂LB-Amp平板37°C培养过夜，挑取单克隆进行测序，构建祀向性沉默化oB 基因的shlihoB慢病毒载体pLVX-U6-shI?hoB-EFl-copGFP-PGK-Puro。
[0072] 实施例4 :sh化oB慢病毒表达载体对目的基因化oB的沉默效果
[0073] 使用实施例3制备的sh化oB慢病毒表达载体进行慢病毒包装，感染PASMC上，通 过Western Blot对目的基因化oB进行沉默效果的验证，具体包括W下步骤：
[0074] 1. sh化oB慢病毒干扰载体的慢病毒包装：
[00巧](1. 1)使用无四环素的培养液培养293T细胞，转染细胞前一天接种293T细胞于 100mm板（10血无四环素DMEM)，培养12~24h。 阳076] (1. 2)待细胞的密度达到80-90%，该转染体系每组需要的质粒混合液为17. 1μg 包装质粒（Addgene公司）和 6. 9μgpLVX-U6-sh化oB-EFl-copGFP-PGK-Puro的shRNA慢 病毒重组质粒，将上述质粒充分混匀后，补加化Cl(150mM)使终体积为500μL;每组需要转 染试剂63μΙΡΕΙ+437μΙ化Cl(150mM)，终体积为500yL。实验W针对非祀基因序列的 shcontroT區病毒载体为对照。
[0077] (1. 3)分别将转染试剂与质粒混合液充分混匀，室溫静置lOmin。 阳07引 （1. 4)将体积为ImL的混合液逐滴缓缓滴加到100mm的培养皿中，37°C培养箱培养 8-1化后，换新鲜的无四环素培养液；为了提高病毒的浓度，换液时可W改为8mL培养液。
[0079] (1. 5)再培养4化后收集上清，换成新鲜的无四环素培养液于培养皿中。3500rpm 离屯、lOmin，收集的上清液，即相应的病毒液。
[0080] (1. 6)每管平均分装约700μL至Ij1. 5血灭菌的EP管中。7化后同样方法处理，收 集病毒上清液。 柳81] 2.PASMC的细胞培养
[0082] 细胞培养：PASMC(人肺动脉平滑肌原代细胞）均购自Lonza(Wa化ersville，MD)， 于含有5%FBS的SmGM-2完全培养基化onza)中培养，收集生长状态良好的细胞，离屯、计 数，W6X1〇5每孔接种于60mm皿内，37°C，5 %C02培养2地。
[0083] 3.shlihoB慢病毒感染PASMC:
[0084] (3. 1)将PASMC种于6孔板，细胞密度为1. 5X105个细胞/孔。 阳0化](3. 2)培养12~2地后，分别用500μLDMEM+500μLsh化oB慢病毒液+0. 5μL polybrene(聚凝胺，终浓度为10μg/μL)的混合液感染PASMC。W针对非祀基因序列的 shcontrol慢病毒表达载体及慢病毒，作为基因sh化oB慢病毒表达载体及慢病毒的对照， 感染PASMC。
[0086] (3. 3)感染病毒24h后换新鲜培养液。 阳087] (3. 4)细胞感染病毒7化后，观察巧光，并加入终浓度为1μg/μL的嚷岭霉素 (puromycin)培养液继续培养细胞，直至筛选出稳定感染sh化ο