Β慢病毒的细胞系。
[0088] 4.Westernblot检测蛋白质的表达水平：
[0089] (4. 1)裂解稳定感染sh化oB、shcont;r〇r區病毒的PASMC，收集蛋白样品，进行蛋白 质定量后，取40μg的蛋白质样品上样，在lOOv恒压进行SDS-PAGE电泳。
[0090] (4.。转膜：200mA恒流1. 5h，转膜后，将膜放置于5 %脱脂奶粉封闭液中封闭比， 再用TBST将膜洗两遍。
[0091] (4.3)加入用3%脱脂奶粉配制的ID1-抗（1:1000稀释），放置于摇床中，4°C过 夜。
[0092] (4.4)第二天用TBST将膜洗Ξ次，每次5min，加入用3 %脱脂奶粉配制的二抗 (1:5000稀释），置室溫杂交比后进行显色（或化学发光自显影反应）。
[0093] 结果如图1所示，与感染了shcontror區病毒的对照组相比，感染了sh化oB慢病 毒的PASMC中的化oB表达量均有明显的下调，说明使用本发明设计的shRNA引物制备得到 的sh化oB及其慢病毒表达载体，对于PASMC的化oB有明显的沉默作用。
[0094] 实施例5 :sh化oB能抑制PASMC的增殖
[0095] 细胞增殖实验：由于缺氧条件会促进PASMC的增殖，而缺氧亦能使化oB的表达 水平较常氧相比发生明显上调。所W，为探讨下调化oB表达对PASMC的调控作用，本实施 例WPASMC作为实验组，在实施例3成功验证本发明设计的sh化oB对化oB中有显著下调 的基础上，在缺氧条件下分别转染实施例3中的shcontrol、sh化oB慢病毒表达载体，然 后通过E加细胞增殖检测法确定细胞的增殖水平。使用E加细胞增殖检测试剂盒（锐博 生物）进行E加标记，根据试剂盒说明书进行实验操作。简略的说，接种约IX104个细胞 于48孔板，培养24h后即进行转染实验，第二天缺氧或常氧下培养2地，然后加入20μΜ E加继续培养2地。细胞取出后用4%多聚甲醒室溫固定30min，0. 5%TritonX-100透化 10min，PBS清洗细胞，然后每孔细胞加入150μΙIXApollo染色反应液反应30min。DM用 IX化chest33342 (150μL每孔）染色5min，在巧光显微镜下拍照。结果表明，在缺氧条件 下，与shcontrol组相比，转染sh化oB慢病毒表达载体后，使PASMC的增殖下降50 %，如图 2A~2B所示，其中，图2A巧光显微镜下观察的PASMC的结果图，图2B为根据巧光显微镜观 察结果，对细胞计数后分析增殖的检测结果图。该实验结果证实，使用本发明设计的sh化oB 及其慢病毒表达载体能显著下调PASMC中化oB的表达水平，可W抑制缺氧引起的PASMC异 常增殖。
[0096] 实施例6 :sh化oB能抑制PASMC的迁移
[0097] 细胞迁移实验：为探讨通过sh化oB慢病毒载体下调化oB的表达后，对PASMC迁移 过程中的影响，本实施例采用侵袭小室（Transwell)方法对PASMC的迁移情况进行评估。侵 袭小室（CorningLifeSciences，3422)的孔径是8μπι。操作步骤，简要地说，首先将PASMC 种于12孔板，细胞生长达到70%时进行转染，使用脂质体法将3山3〇11付〇1和3}1化〇8慢病 毒表达载体分别转入细胞，第二天收集细胞并计数；接种5X104个细胞于小室中，小室加入 250μLSmGM-2完全培养基，底部加入750μLSmGM-2完全培养基，接种后的第二天将小室 培养基更换成含0. 5%FBS的SmGM-2培养基进行饥饿，常氧或缺氧培养2地，结晶紫染色观 察迁移到小室底部的细胞，计数分析。实验结果显示，与常氧培养相比，缺氧刺激24h可使 PASMC迁移率增加；而在缺氧刺激的条件下，与shcontrol相比，转染了sh化oB慢病毒表达 载体的PASMC迁移率明显降低，如图3所示，图中显示了PASMC的经常氧和缺氧不同处理状 态下的细胞迁移率比较，还显示了缺氧条件下shcontrol和sh化oB慢病毒载体后细胞迁移 率的变化。
[0098] 综上所述，本发明针对化0激酶信号通路的关键因子化oB设计了shRNA序列，并 构建了相应的shRNA慢病毒沉默载体。通过实验结果证实本发明的shRNA能够显著沉默 化oB的表达。鉴于化oB作为一种潜在的肺动脉高压治疗祀点，因此本发明的提供的化oB的 ShRNA及其相关生物试剂，可用于研究和制备治疗肺动脉高压的相关疾病的药物。另外，本 发明证实抑制化oB基因表达可抑制人肺动脉平滑肌细胞（PASMC)的异常增殖和迁移，证明 化oB是一种潜在的治疗肺动脉高压的新型祀点，有利于进一步研究由化〇/化〇激酶信号通 路异常激活所引起的疾病包括屯、血管疾病、神经系统疾病和肿瘤相关疾病发生发展机制。
[0099] 应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可 W根据上述说明加W改进或变换，所有运些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保 护范围。 阳 100]
[0101]
【主权项】
1. 一种靶向性沉默RhoB的shRNA序列，其特征在于，其中包含用于沉默目的基因RhoB 的靶位点序列 5' -CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT-3'。2. -种用于制备如权利要求1所述的shRNA序列的引物，其特征在于，引物序列如下： 上游引物序列shRhoB-Pl:5'-ACCGCGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGA ACACG-3，； 下游引物序列shRhoB-P2 :5'-AAAACGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGA ACACG-3, 。3. -种shRNA慢病毒载体，其特征在于，所述shRNA慢病毒载体用于表达如权利要求 1所述的shRNA序列，所述shRNA慢病毒载体中包含用于沉默目的基因RhoB的靶位点序列 5' -CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT-3'。4. 根据权利要求3所述的shRNA慢病毒载体，其特征在于，所述shRNA慢病毒载体中包 含采用以下引物退火合成得到的shRNA序列；引物序列如下： 上游引物序列shRhoB-Pl:5'-ACCGCGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGA ACACG-3，； 下游引物序列shRhoB-P2 :5'-AAAACGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGA ACACG-3, 。5. -种如权利要求4所述的shRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步 骤： 采用引物退火合成shRNA序列；其中，上游引物序列shRhoB-Pl:5'-ACCGCGTGTTCAGTAA GGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3' ；下游引物序列shRhoB-P2 :5'-AAAACGTGTTC AGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3' ； 将合成的shRNA序列连接到shRNA慢病毒载体上； 转入大肠杆菌感受态细胞stable3,涂LB-Amp平板培养过夜，随机挑取一个单克隆进 行测序验证，构建得到用于表达靶向性沉默RhoB的shRNA序列的shRNA慢病毒载体。6. 根据权利要求5所述的shRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，将合成的shRNA 序列连接到shRNA慢病毒载体上的过程包括以下步骤： 以pCDFl-MCS2-EFl-copGFP载体为模板，PCR扩增得到EFl-copGFP片段，用Mlul和Afel双酶切PCR产物，插入到同样经过Mlul和Afel双酶切的慢病毒载体pLVX-Puro上，得 到载体骨架pLVX-EFl-copGFP-PGK-Puro; 用Clal和Xhol双酶切载体骨架pLVX-EFl-copGFP-PGK-Puro,去磷酸后电泳回收；用Clal和Xhol双酶切U6启动子，与酶切后的载体pLVX-EFl-copGFP-Puro连接； PCR扩增大肠杆菌ccdB致死基因，用Xhol和MluI双酶切后，与经过Xhol和MluI双 酶切的pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro载体连接，得到用于表达shRhoB的shRNA慢病毒载 体pLVX-U6-ccdB-EFl-copGFP-PGK-Puro; 用BsmBI单酶切shRNA慢病毒载体pLVX-U6-ccdB-EFl-copGFP-PGK-Puro,将退火合成 的shRhoB序列与pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro载体骨架通过相应的酶切位点连接。7. -种如权利要求1所述的靶向性沉默RhoB的shRNA序列的应用，其特征在于，将所 述shRNA序列用于制备抑制RhoB基因表达的生物制剂。8. 根据权利要求7所述的靶向性沉默RhoB的shRNA序列的应用，其特征在于，所述
【专利摘要】本发明公开一种靶向性沉默RhoB的shRNA序列、引物、应用、shRNA慢病毒载体及构建方法，本发明针对Rho激酶信号通路的关键因子RhoB设计了shRNA序列，并构建了相应的shRNA慢病毒沉默载体。所述shRNA序列包含序列5’-CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT-3’。通过实验结果证实本发明的shRNA能够显著沉默RhoB的表达。鉴于RhoB作为一种潜在的肺动脉高压治疗靶点，因此本发明的提供的RhoB的shRNA及其相关生物试剂，可用于研究和制备治疗肺动脉高压的相关疾病的药物。
【IPC分类】C12N15/867, C12N15/113, C12N15/11, C12N15/66, A61P9/00, A61K31/7088
【公开号】CN105255894
【申请号】CN201510747132
【发明人】苟德明, 康康, 李洁璇, 黄炼, 张利敏, 牛燕琴, 姚丽君, 吴伊可
【申请人】深圳大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月5日