抑制ebf1/ebf2基因表达的rna元件、检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，尤其设及一种抑制邸F1/邸F2基因表达的RNA元 件、检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 植物激素乙締信号转导中两个关键的转录因子EIN3/EIL1在蛋白水平上受到由 两个F-Box类蛋白邸F1/邸F2所介导的泛素化降解调控。中国专利化2011 1 0110101.0 公开了有乙締时邸F1/2mRNA的3'UTR能够抑制其自身mRNA的翻译，从而使邸F1/2蛋白 合成减少。
[0003]EBF1,邸F2基因成熟mRNA的3，UTR分别为643nt和590nt，在运么长的3，UTR中， 是什么元件介导mRNA翻译抑制尚不清楚。
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供抑制邸F1/邸F2基因表达的RNA元件、检测方法及其应用。
[0005] 本发明解决技术问题采用如下技术方案：一种抑制邸F1/邸F2基因表达的RNA元 件，包括一串连续的尿喀晚巧PU)。
[0006] 优选地，所述尿喀晚在RNA茎环结构的环上。
[0007] 优选地，所述尿喀晚序列长度为6-lOnt，包括核屯、序列和在核屯、系列两侧或一侧 的其他类型碱基。
[0008] 优选地，其中核屯、序列为长度5-8nt的连续尿喀晚。
[0009] 一种抑制邸F1/邸F2基因表达的RNA元件的检测方法，包括如下步骤：
[0010] (1)构建重组载体，邸F1和邸F2的3'UTR按长度分段，分别插入祀GAD载体中GFP 的编码区之后；
[0011] (2)两组重组载体分别转入野生型拟南芥Co^0中，得到稳定遗传的转基因株系； 阳01引 做对步骤似所得转基因株系进行乙締处理；
[0013] (4)检测巧光强度。
[0014] 抑制邸F1/EBF2基因表达的RNA元件在3'UTR过表达植株表现出乙締不敏感表型 中的应用。
[0015] 抑制邸F1/邸F2基因表达的RNA元件在增强内源邸F1/EBF2mRNA翻译过程中的 应用。
[0016] 本发明首次公开了抑制邸F1/邸F2基因表达的RNA元件为EPU序列，并构建重组 载体，转入野生型植株中，得到稳定遗传的转基因株系，进而检测其功能元件，EBF1/邸F2基 因中EPU序列的过表达或缺失介导着mRNA的翻译抑制或表达，在植物中过表达EPU后可产 生于过表达邸F1/邸F2基因编码序列相同的生物学效应，为进一步研究调控植物生长发育 奠定基础。
【附图说明】
[0017]图1为祀GAD载体； 阳01引图2为具有翻译抑制功能的片段共有的序列EPU的示意图；
[0019] 图3为邸F1 3'UTR的7个EPU序列位于茎环结构的环上的示意图；
[0020] 图4为去掉7个EPU之后的邸F1 3'UTR二级结构的示意图； 阳02U 图5为EPU介导3'UTR的翻译抑制作用的检测结果； 阳02引图6为邸F2 3'UTR的5个EPU介导邸F2mRNA的翻译抑制作用的检测结果； 阳02引 图7为EPU缺失后的邸F1/2mRNA的翻译不受抑制的检测结果；
[0024]图8为EPU对3'UTR过表达植株产生乙締不敏感表型的检测结果； 阳02引 图9为过表达EPU增强内源邸F1/2mRNA的翻译的检测结果。
【具体实施方式】
[00%] 下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步阐述。 阳〇27] 实施例1
[0028] 本实施例提供一种抑制邸F1/邸F2基因表达的RNA元件。通过将邸F1和邸F2 的3'UTR按长度分别分为5段，插入到图1所示的祀GAD载体中GFP的编码区的终止密 码子后面，将不同的重组载体分别转入野生型拟南芥Col-0中，得到稳定遗传的转基因株 系，继而进行乙締处理，处理后分别观察GFP巧光强度；两组中均有片段可W使GFP巧光 变弱，由此说明邸F1和邸F2的3'UTR均表现出对mRNA的翻译抑制作用。进而对运两组 片段中具有翻译抑制功能的片段进行序列分析，用MEME网站http://meme-suite.org/ tools/meme进行多序列比对，预测运些序列中共有的元件，发现运些有翻译抑制功能的核 屯、序列为长度5-8nt的连续尿喀晚，进一步确定核屯、序列长度为7-8nt的连续尿喀晚，并确 定序列为在此核屯、序列两侧或一侧添加其他类型碱基至长度为6-lOnt。将运些有翻译抑 制功能的连续尿喀晚扣）片段，命名为ElthyleneResponsiveRNAelementscontaining 化Iy-U;rid5dates巧PU)，其序列如图2所示。如图3所示，用RNAfold网站(http://rna. 忧i.univie.ac.at/cRi-bin/RNAfold.cRi)对EPU进行二级结构分析，结果显示运些尿喀 晚都在RNA茎环结构的环上，在邸F1mRNA3'UTR中，共有7个位于环上的EPU。如图4所 示，当将邸F1mRNA3'UTR中的7个EPU都去掉之后，整体二级结构并没有明显变化。
[0029] 实施例2
[0030] 本实施例提供EPU在介导邸F1 3'UTR的翻译抑制作用中的应用，将去掉7个EPU 之后的邸F1 3'UTR(图4所示）插入祀GAD载体（图1所示）中，转入野生型拟南芥Co^0 中。如图5A所示，检测生长在含有10μΜ乙締合成前体ACC的MS板上的各株系中GFP巧 光强度，去掉EPU的转基因株系中GFP巧光强度与过表达GFP的巧光强度几乎相同，显著强 于中国专利化201110110101.0中公开的G1U(35S::GFP-EBF1U/Col-〇)过表达的植株中 GFP巧光强度。由此说明，EPU是3'UTR介导翻译抑制所必需。如图5B所示，进一步设计 包含EPU的茎环结构，两端用完全配对的碱基序列保证EPU位于环上，每个环上有两串EPU， 做成3个重复形式即6xEPU，进而过表达在野生型拟南芥Col-0中。如图5C所示，检测各 株系中GFP巧光强度，在10μΜACC板上，过表达6xEPU的转基因植株中GFP巧光很弱，与 G1U(35S: :GFP-EBF1U/Col-〇)过表达的植株中GFP巧光强度差不多，由此说明EPU是介导 邸FI3'UTR翻译抑制的充分必要条件。 阳0川 实施例3 阳03引本实施例提供EPU在介导邸F2 3'UTR的翻译抑制作用中的应用。如图6A所示， 与邸F1 3'UTR类似，在邸F2 3'UTR中，鉴定到了 5个EPU。如图她所示，将5个EPU都 去掉后并不影响邸F2mRNA3'UTR整体二级结构；如图6C所示，去掉5个EPU之后，转基 因植株中的GFP巧光强度显著增强。由此说明，去掉EPU后邸F2mRNA的翻译不受抑制，即 EPU是介导邸F2 3'UTR翻译抑制的充分必要条件。
[0033] 上述实验结果表明，邸F1和邸F2的mRNA3'UTR上的EPU作为一个顺式作用元 件能抑制由mRNA到蛋白的翻译过程。
[0034] 实施例4
[0035] 本实施例提供抑制邸F1/EBF2基因表达的RNA元件在3'UTR过表达植株表现出乙 締不敏感表型中的应用。经典的乙締反应就是人们所熟知的Ξ重反应，具体表现为当对植 株施加乙締时黄化苗呈现出下胚轴变短、变粗，根变短，顶端弯钩加剧。本实施例构建了内 源启动子启动的带GFP标签的编码区加全长3'UTR(P邸F1: :G1巧重组载体和编码区去掉7 个EPU的3'UTR(祀BF1: :G1FΔ7U)重组载体，分别转入拟南芥ebn突变体中。观察在含 有ΙΟμΜACC(-种乙締生物合成的前体）的培养基上生长3天的黄化苗的表型，如图7A所 示，pEFl: :GlF/ebfl恢复了ebn突变体的乙締超敏感表型，而祀BF1: :GlFA7U/ebn则几 乎完全乙締不敏感。本实施例中转基因植株由内源启动子启动且转入ebn突变体中，相当 于将内源邸F1基因3'UTR上的7个EPU去掉，此时没有EPU的3'UTR不再抑制邸F1mRNA 的翻译过程，邸F1蛋白合成增多，降解EIN3蛋白，导致乙締不敏感表型。同时，检测运些转 基因植物中邸F1基因的表达，如图7B所示，可W看出运些转基因植物中邸F1的表达量与 野生型拟南芥Col-0基本一致。如图7C所示，通过westernblot实验对内源EIN3抗体检 巧リ，结果表明即使加了ACC，祀BFl::GlFΔ7Ul/ebn中也几乎检测不到内源EIN3蛋白，运 与其乙締不敏感表型一致。由此可知，EBF1 3'UTR上的EPU缺失则邸F1mRNA的翻译不再 受抑制，转基因植株表现出乙締不敏感表型；带有EPU则邸F1mRNA的翻译受抑制，转基因 植株表现出正常的乙締反应。
[0036] 如图8A和8B所示，当邸F1 3'UTR中的7个EPU去掉，EBF2 3'UTR的5个EPU都 去掉之后，过表达植株则不再有乙締不敏感表型；如图8C所示，过表达重复形式的EPU，则 有与全长3'UTR过表达相似的乙締不敏感表型。上述实验结果说明，EPU是3'UTR过表达 植株表现出乙締不敏感表型的充分必要条件。
[0037] 实施例5
[0038] 本实施例提供抑制邸F1/邸F2基因表达的RNA元件在增强内源邸Fl/EBF2mRNA翻 译过程中的应用。如图9A和9B所示，polysomeprofiling实验中，在6xEPU过表达的植株 中，与polysome结合的邸F1/2mRNA(即处于翻译状态的邸F1/2mRNA)显著增加，即过表达 EPU增强了内源邸F1/2mRNA的翻译。而EIN3及看家基因β-ATP的翻译则不受过表达的 6xEPU影响，说明过表达的EPU特异调控邸F1/2mRNA的翻译过程。本实施例中polysome profili实验操作使用ARTseq?化bosomeProfilingKit并依据其说明书进行，只是不进 行酶切建库而直接进入超速离屯、和吸光度测定；之后的RNA提取使用QIAGENRNeasyPlant MiniKit,反牵专录使用PrimeScript严StandcDNASynthesisKit。
[0039]W上实施例的先后顺序仅为便于描述，不代表实施例的优劣。
[0040] 最后应说明的是：W上实施例仅用W说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽 管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然 可W对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替 换；而运些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精 神和范围。
【主权项】
1. 一种抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件，其特征在于，包括一串连续的尿嘧啶 (EPU) 〇2. 根据权利要求1所述的RNA元件，其特征在于，所述尿嘧啶在RNA茎环结构的环上。3. 根据权利要求1或2所述的RNA元件，其特征在于，所述尿啼啶序列长度为6-10nt， 包括核心序列和在核心系列两侧或一侧的其他类型碱基。4. 根据权利要求3所述的RNA元件，其特征在于，其中核心序列为长度5-8nt的连续尿 嘧啶。5. -种抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： ⑴构建重组载体，EBF1和EBF2的3'UTR按长度分段，分别插入pEGAD载体中GFP的 编码区之后； (2) 两组重组载体分别转入野生型拟南芥Col-Ο中，得到稳定遗传的转基因株系； (3) 对步骤（2)所得转基因株系进行乙烯处理； (4) 检测荧光强度。6. 根据权利要求1所述抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件在3'UTR过表达植株表 现出乙烯不敏感表型中的应用。7. 根据权利要求1所述抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件在增强内源EBF1/ EBF2mRNA翻译过程中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种抑制EBF1/EBF2基因表达的RNA元件，包括一串连续的尿嘧啶(EPU)，并构建重组载体，转入野生型植株中，得到稳定遗传的转基因株系，进而检测其功能元件，EBF1/EBF2基因中EPU序列的过表达或缺失介导着mRNA的翻译抑制或表达，在植物中过表达EPU后可产生于过表达EBF1/EBF2基因编码序列相同的生物学效应，为进一步研究调控植物生长发育奠定基础。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/113, G01N27/64, C12N15/82
【公开号】CN105255891
【申请号】CN201510683938
【发明人】郭红卫, 马梦迪
【申请人】北京大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月20日