染后48小时，收获来自各Τ-25瓶的0. 5ml上清液，将其短暂旋 转并将20μL置于新的离心管中。将5μL的5倍减少样品缓冲（Pierce)添加至各管中， 将各样品在1〇〇°C加热5分钟及随后置于冰上冷却。将20μL的各样品装载在4-15%预制 的SDS-PAGE(Biorad)上，及在150V下运行所述凝胶约70分钟。使用iblot干式转印系 统（Invitrogen)，根据供应商的方法使用PVDF凝胶转移套装将蛋白质从凝胶转移至膜上。 在摇床上、于4°C、20mlPBS-T封闭液（即Dulbeco磷酸盐缓冲盐水（Invitrogen)，其 包含0.2%V/VTween20 (Sigma)和5%W/V脱脂奶粉）中过夜进行膜封闭。随后向20ml PBS-T封闭液（1:2000稀释）添加10μL的单克隆HRP缀合抗-His标记抗体（Qiagen)， 然后在摇床上于室温温育1小时。将膜在PBS-T封闭液中洗5次，将膜在吸水纸上接触干 燥以除去过量封闭液，并利用AmershamECLPlus蛋白质印迹检测系统（GEHealthcare) 进行检测。
[0150] 滚瓶转染及蛋白纯化 使用补加10%胎牛血清（FBS)的DMEM生长培养基在CellBincf滚瓶（Corning) 中使293T生长至融合，除去生长培养基，然后添加250ml预热的Freestyle293表达培养 基（Invitrogen)并在37°C、5%C02下温育2小时。将250Pg的DNA表达载体pVRC8400 嵌合gpl40形式-2与320μL的聚乙稀亚胺（PEI) (1mg/ml)混合，添加至20ml室温的 freestyle293培养基中，在室温下温育20分钟并随后添加在各滚瓶中，然后在37°C、5% C02下温育6天。在更换培养基之后6天收获细胞上清液。通过Ni-NTA(Qiagen)然后尺 寸排阻色谱来纯化组氨酸标记的优化的嵌合gpl40Env形式-2蛋白，其包括SEQIDNO: 2。简言之，在澄清旋转并向10mM的最终浓缩物中添加咪唑之后，将细胞上清液以0.8mL/min的流速载入镍柱并用20mM咪唑的PBS溶液洗涤，然后用40mM咪唑的PBS溶液进一 步洗涤。随后用300mM咪唑的PBS溶液洗脱蛋白。将含有纯化蛋白的部分进行汇集、浓 缩、及进一步通过在柱中的Superose6(GEHealthcare)的凝胶过滤色谱纯化，其中运行 缓冲液含有25mMTris(pH7. 5)和150mMNaCl。将纯化的蛋白进行浓缩、在液氮中冷 冻、在-80 °C下储存。
[0151] 动物和免疫 在机构实验动物照料和使用委员会（InstitutionalAnimalCareandUse Committee)批准的方法下将远系繁殖的雌性Hartley豚鼠（ElmHillLabs)安置在贝丝以 色列女执事医疗中心动物研究所（AnimalResearchFacilityofBethIsraelDeaconess MedicalCenter) 〇豚鼠通过使用以下物质在上四头肌上进行两侧肌内注射来免疫：分化 体Cgpl40Env多肽（即，包括cEnv(SEQIDN0: 3)的氨基酸序列的三个分子的同三聚 体）、嵌合gpl40Env(即，包括mEnv(SEQIDNO: 1)的氨基酸序列的三个分子的同三聚 体）、或分化体Cgpl40Env/嵌合gpl40Env混合物（100yg/动物），所述注射以4周的间 隔（第0、4、和8周），使用 500μL包含 15% (v/v)水包油Emulsigen(MVPLaboratories)/ PBS和 50μg的免疫刺激性双-核苷酸CpGDNA(5'-TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT-3'） (MidlandReagentCompany)的双佐剂组合。分化体Cgpl40Env/ 嵌合gpl40Env混合 物含有50yg的每种蛋白。在每次免疫进行以后四周从麻醉动物的腔静脉获得血清样品。
[0152] TZM.Μ细胞中的中和抗体测定 通过在TZM.bl细胞使用基于荧光素酶的病毒中和测定来测量对抗HIV-1Env假病毒 的中和抗体应答。这些测定测量单轮病毒感染之后在TZM-bl细胞中荧光素酶报道基因表 达的减少。ID5。作为导致在扣除细胞对照相对发光单位之后，与病毒对照孔相比较，相对发 光单位减少50%的血清稀释计算。简言之，一式两份（96孔平底板）在10%DMEM生长培 养基（每孔100μ1)中进行血清样品的三倍系列稀释。将病毒以50μ1的体积添加至各 孔中，并将板在37 °C下温育1小时。随后将TZM.bl细胞以11μg/ml的最终浓度添加 至10%DMEM生长培养基（100μ1体积，每孔lxlO4个细胞）中，所述培养基含有二乙氨 乙基葡聚糖（Sigma)。所有测定中均包括鼠白血病病毒（MuLV)阴性对照。HIV-1包膜假病 毒包括分化体A(MS208.A1 和Q23. 17)分离株、分化体B(SF162.LS、BaL. 26、SS1196. 1 和 6535.3)、和分化体（：（丽965.26、171.21、2]\1109?.?84和2]\1197]\1?87)分离株。
[0153] 实施例2.本发明优化的嵌合gpl40Envl三聚体的生成 已按以下方式从mEnv(包括SEQIDNO: 1的氨基酸序列的多肽）修饰mEnv+ (包 括SEQIDN0: 2的氨基酸序列的多肽）。首先，已使前导肽分泌序列与在稳定的分化体C gpl40Env(cEnv)三聚体多肽组分（SEQIDN0: 3)中使用的相同。第二，已将裂解位点 突变并入gpl20和gp41部分之间以进一步增强稳定性。第三，已将因子Xa蛋白酶裂解位 点（SRIEGR)并入foldon三聚化结构域的上游。三种Env多肽的氨基酸序列（SEQIDN0: 1-3)和存在于各自中的具体的修饰在图1A-1C中描绘。
[0154] 令人惊奇地，这些修饰产生显著稳定的gpl40Envl三聚体（如本发明的mEnv+ 三聚体）。为评估稳定性，我们首先通过蛋白质印迹分析比较mEnv+相对于mEnv的表达 水平。为此，将含有80%融合293T细胞的T-25瓶用表达mEnv或mEnv+的真核表达载体 PVRC8400,使用脂转染胺2000 (Invitrogen)进行转染并通过蛋白质印迹免疫检测使用抗 组氨酸标记HRP(Qiagen)分析1〇μ1的各上清液。图2分别在通道3和4描绘了显示mEnv 和mEnv+的表达水平的蛋白质印迹。值得注意地，与mEnv或用作阳性对照（见通道1)的 cEnv的表达水平相比较，mEnv+的表达水平显著更高。在该实验中，空白pVRC8400用作阴 性对照（见通道2)。
[0155] 如上所指出的，mEnv+在293T细胞中表达并在细胞裂解和净化之后根据His标记 使用Ni-NTA(Qiagen)柱纯化。将在咪唑洗脱后收集的部分汇集、浓缩、及进一步通过在柱 中的Superose6(GEHealthcare)的凝胶过滤色谱纯化，其中运行缓冲液含有25mMTris (pH7. 5)和150mMNaCl。描绘来自Superose6柱中的mEnv+洗脱的色谱迹线描绘在图3 中。随后在4-15%预制的SDS-PAGE凝胶上单独测定峰馏分（即在图3中峰曲线以下获得 的部分）（图4)。所述SDS-PAGE凝胶证明凝胶过滤纯化成功地得到mEnv+多肽的同源群 的分离。如在此进一步描述的，使用一组来自分化体A、B、和C的1级分离株在豚鼠中评估 这些稳定的gpl40Env三聚体（mEnv和mEnv+的同三聚体二者，以及mEnv和cEnv同三聚 体的组合）的免疫原性。
[0156] 实施例3.中和抗体应答分析 候选Env免疫原的临床前评估对于概念测试及对于疫苗候选者的优先化是关键性的。 在TZM.bl细胞中基于荧光素酶的病毒中和测定（Li等人（2005)J.Virol. 79:10108; Montefiori(2005)Curr.Prot.Immunol.第12章：第1211单元）已发展为可被标准化 的高通量测定（Montefiori(2009)MethodsMol.Biol. 485:395;Polonis等人（2008) Virology375:315)。基于分子克隆的Env-假型病毒的单轮感染在TZM-bl细胞（遗传工 程改造的细胞系，其表达⑶4、CXCR4和CCR5并含有Tat诱导型Luc和β-Gal报道基因） 中进行荧光素酶报道基因测定。该测定在单轮感染中产生高成功率、提高的测定容量（如 两天测定）、提高的精确度（如准确测量的50%中和）、及改善的标准化水平（如稳定的细 胞系）。荧光素酶报道基因测定是优选并有效的。
[0157] 为评估由本发明的稳定的gpl40Env三聚体提供的中和曲线，TZM.bl测定以如 下方式进行：其中将在使用cEnv同三聚体、mEnv同三聚体、或cEnv和mEnv同三聚体二者 接种前（前）和第三次接种之后四周（后）获得的豚鼠血清相对于1级中和敏感的分离株 的多分化体组和鼠白血病病毒（MuLV)(阴性对照）进行测试，所述分化体组包括分化体B (SF162.LS和Bal.26)、和分化体C(MW965.26 和TV1.21)HIV-1 包膜假病毒（图 5A-5C)。
[0158]TZM.bl测定还以如下方式进行：其中将在使用cEnv同三聚体、mEnv同三聚体、或 cEnv和mEnv同三聚体二者接种前（前）和第三次接种之后四周（后）获得的豚鼠血清相对 中等中和敏感的1级（1B级）分化体A分离株（MS208.A1和Q23.17)(图6A-6B)、高度中 和敏感的（1A级）和1B级分化体B分离株（SF162.LS、BaL. 26、SS1196. 1、和6535. 3)(图 7A-7D)、及 1A级和 1B级分化体C分离株（MW965. 26、TVL21、ZM109RPB4、和ZM197M. PB7)(图8A-8D)的HIV-1包膜假病毒进行测试。
[0159] 出人意料地，ID5。效价数据的定量共同证明了cEnv和mEnv同三聚体的组合诱导 了优于cEnv或mEnv单独使用的中和抗体应答。具体地，就扩展诱导的中和抗体应答的广 度而言，cEnv和mEnv的组合是特别令人惊奇的。此类中和抗体广度的扩展此前未有描述 且在本领域中是重要的未满足的需求。
[0160] 实施例4.使用本发明的组合物治疗对象中HIV感染或降低其HIV感染的风险 可向对象（如感染HIV或具有HIV感染风险的人）以基础-加强免疫接种方案来施 用本发明的组合物（如本发明的疫苗）以治疗有需要的对象中HIV感染或降低其HIV感 染风险。例如，可将一种或更多种本发明的组合物，例如包括mEnv、mEnv+、或cEnv三聚体、 或mEnv与cEnv或mEnv+与cEnv三聚体的组合的疫苗作为加强免疫施用。在加强免疫施 用之前，向所述对象施用作为基础免疫接种的至少一种第一载体，所述第一载体包括编码 多肽的第一核酸分子，所述多肽与SEQIDN0: 6具有至少85%氨基酸序列同一性（如 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 同一性），或具有SEQ IDN0: 6的序列，及任选地第二载体，所述第二载体包括编码多肽的第二核酸分子，所述多 肽与SEQIDN0: 7 具有至少 85% 同一性（如 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、或99%同一性），或具有SEQIDN0:7的序列。
[0161] 优选将组合物以提供足够水平的稳定的gpl40Env三聚体基因产物的量施用 (如在对象中引出由免疫原性三聚体引起的免疫应答而没有过度不良的生理效应的稳定的 gpl40Env三聚体的水平）。若组合物是非载体的，则施用的多肽组合物可包括介于约1Pg 和1mg之间的稳定的Env三聚体，并更优选介于50Pg和300Pg之间的本发明的稳定的 Env三聚体。或者，可向所述对象以病毒载体形式施用至少约lxlO3病毒颗粒（vp)/剂量 或介于lxlO1和1x10 14vp/剂量之间，优选介于lxlO3和1x10 12vp/剂量之间，并更优选介 于lxlO5和1x10 11vp/剂量之间。
[0162] 在以基础-加强免疫方案施用本发明的组合物后，可评估患者一种或更多种症状 的变化或，特别地，治疗对象中的HIV效价水平，且如上所述需要时可重复所述方案。
[0163] 实施例5.mEnv三聚体与cEnv三聚体的组合引出相对于任一单独的三聚体更优 的中和抗体应答 引言 可引出对抗各种各样的、循环的HIV-1病毒株的结合和nAb二者的HIV-1Env糖 蛋白免疫原的产生是HIV-1疫苗开发的主要目标（Stephenson等人（2013)1臟11]1〇1· Rev. 254:295;Srivastava等人（2005)Hum.Vaccin. 1:45;Barouch(2008)Nature. 455:613;KarlssonHedestam等人（2008)Nat.Rev.Microbiol. 6:143;Mascola等人 (2010)Annu.Rev.Immunol. 28:413)。表面Env糖蛋白，其为中和抗体的主要革巴标，包含 通过非共价相互作用缔合的gpl20受体-结合亚单位和gp41融合亚单位并作为三聚体刺 突（trimericspike) (gpl20/gp41)3存在于病毒表面。在天然HIV-1感染的过程中，大多 数个体诱导具有有限的中和能力的抗-Env抗体应答，且在基因中的变异性可高达30% (Louwagie等人（1995)J.Virol. 69:263;Kalish等人（1995)Aids. 9:851;Korber 等人（2001)Br.Med.Bull. 58:19)，其对于全球相关的基于Env的免疫原的开发提出了 主要挑战。然而，已报道约10 - 25%的感染HIV-1的个体具有产生广泛中和抗体（bnAb)的 能力（Stamatatos等人（2009)Nat.Med. 15:866)，提供了使用适当的Env免疫原可实 现类似应答的理论基础。近期的研究已突出此类bnAb在慢性感染致病性猿猴-人免疫缺 陷病毒SHIV-SF162P3的猕猴中的治疗功效（Barouch等人（2013)Nature. 503:224)。
[0164] 解决HIV-1序列多样性的一个策略已利用生物信息学上优化的'嵌合'蛋白 (Fischer等人（2007)Nat.Med. 13:100)，其为经由电脑模拟的重组HIV-1序列，被设计 用于改进全球HIV-1多样性的范围。数个非人灵长类动物中的概念验证免疫原性研究已证 明，当与共有和/或天然序列抗原相比较时，载体编码的嵌合抗原可增加细胞免疫应答的 深度和广度并还改善抗体应答（Stephenson等人（2012)J.Virol. 86:11434;Barouch 等人（2010)Nat.Med. 16:319;Santra等人（2010)Nat.Med. 16:324;Santra等人 (2012)Virology. 428:121)。最近我们也报道了基于载体的HIV-1嵌合抗原对于猕猴中 的SHIV挑战的保护性功效（Barouch等人（2013)Cell. 155:531)。然而，之前并未描述 HIV-1嵌合Env蛋白免疫原的生成和评估。
[0165] 在本研究中，我们报道了嵌合Mgpl40三聚体（mEnv)的生产和表征。通过表面等 离子体共振，mEnv结合CD4 及包括VRC01、PGT121、PGT126、PG9、PG16、和 3BNC117 的数个 bnAb，证明了三聚体是完整的并呈现这些相关表位。在TZM.bl测定中，mEnv也展现出感染 革巴细胞的功能性能力。豚鼠中的免疫原性研究显示，mEnv引出高结合抗体效价、交叉分化 体1级TZM.blnAb和可检测的2级A3R5nAb，其为与由我们的分化体Cgpl40三聚体 (cEnv)引出的那些不相同的范围。mEnv和cEnv的混合物引出的nAb应答证明加成作用并 优于任一单独的三聚体。
[0166] 方法 HIV-1Env蛋白的生产和表达 从前述计算的优化方法获得命名为mEnv、mEnv2(Barouch等人（2010)Nat.Med. 16:319)和mEnv3的三种合成的gpl40嵌合ΜEnv基因序列，所述序列都含有点突变以 消除裂解和融合活性（Fischer等人（2007)Nat.Med. 13:100;Barouch等人（2010) Nat.Med. 16:319)。通过GeneArt(LifeTechnologies)合成人密码子优化形式。使用 定制引物通过PCR扩增工程改造各构建物以表达C-末端T4噬菌体fibritin'fold-on' 三聚化结构域和多组氨酸基序。将基因克隆至pCMV真核表达载体的及碰奴限制位 点，通过诊断性限制酶切消化验证插入物，对DNA进行测序，并使用l(^gofDNA用脂转染胺 (LifeTechnologies)在293T细胞中进行表达测试。由CodexBiosolutions生成分化体 C(C97ZA. 012)(Kovacs等人（2012)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 109:12111)和 嵌合Mgpl40Env三聚体的稳定的细胞系。对于蛋白生产，所述稳定的细胞系在Dulbeco 改进的Eagle培养基（DMEM)(补加10%FBS、青霉素/链霉素和嘌呤霉素）中生长至融 合并随后更换成补加相同的抗生素的Freestyle293表达培养基（Invitrogen)。在更换 培养基后的96 - 108小时收获细胞上清液，并通过前述Ni-NTA(Qiagen)和尺寸排阻色谱 来纯化His-标记的gpl40 蛋白（Kovacs等人（2012)?1"〇(：.似1:1.4〇&(1.3(3；[.1].3.八· 109:12111;Nkolola等人（2010)J.Virol. 84:3270)。具有C-末端His-标记的全长 嵌合Mgpl20的合成基因产生自使用定制引物通过PCR扩增的mEnv构建物，其利用聚乙烯 亚胺的瞬时转染在293T细胞中生产并随后通过Ni-NTA(Qiagen)及在Superdex200(GE Healthcare)上的尺寸排阻色谱来纯化。通过GeneArt(LifeTechnologies)合成在ΤΖΜ· bl测定中使用的全长嵌合Mgpl60的合成基因并将其克隆至pcDNA?3.l/V5-His-T0P0载 体（Invitrogen)中。
[0167] 蛋白质印迹免疫检测 将具有pCMV-mEnv、mEnv2、或mEnv3gpl40表达构建物的293T细胞的瞬时转染 后48小时获得的上清液（20μL)分开与还原样品缓冲液（Pierce)混合，在100°C下加 热5分钟并在预制的4-15%SDS-PAGE凝胶（Biorad)上运行。使用iBlot干式转印系统 (Invitrogen)将蛋白转移至PVDF膜并在PBS-T[Dulbeco磷酸盐缓冲盐水+ 0.2%V/V Tween20 (Sigma) + 5%W/V脱脂奶粉]中、于4°C下过夜进行膜封闭。过夜封闭之后，将 PVDF膜用含有1:2000稀释的单克隆抗体pentaHis-HRP(Qiagen)的PBS-T温育1小时， 用PBS-T洗5次并使用AmershamECLplus蛋白质印迹检测系统（GEHealthcare)显色。 对于使用2F5和4E10单克隆抗体的蛋白质印迹免疫检测，如上处理分化体A(92UG037. 8) gpl40(Kovacs等人（2012)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 109:12111;Nkolola等 人（2010)J.Virol. 84:3270)和嵌合Mgpl40 蛋白。
[0168] 表面等离子体共振 表面等离子体共振（SPR)在Biacore3000(GEHealthcare)上、在25°C下，利用HBS-EP运行缓冲液（GEHealthcare)进行。遵循生产商（GEHealthcare)的建议进行 可溶性二结构域CD4(Freeman等人（2010)Structure. 18:1632) (1,500RU)或蛋白 A(ThermoScientific)至CM5 芯片的固定。在 300-750RU捕获固定的IgG。以 5〇μ1/ min的流速进行结合实验，其具有2分钟的缔合相和5-分钟的解离相。再生以如下步骤 进行：以100μΙ/min单次注射35mMNaOH和1.3MNaCl，随后是在HBS-EP缓冲液中的3 分钟平衡相。空白表面上的注射从结合数据中扣除用于分析。使用BIAevaluation软件 (GEHealthcare)和Langmuir1:1结合模型确定结合动力学，PG16除外，其使用二价分 析物模型进行确定。所有样品均一式两份运行并产生相似的动力学结果。可溶性二结构 域⑶4如前所述进行制备（Freeman等人（2010)Structure. 18:1632)并由BingChen (波士顿儿童医院（Children'sHospitalBoston))慷慨提供。17b杂交瘤由James Robinson(杜兰大学（TulaneUniversity),NewOrleans,LA)友情提供并如前述进行 纯化（Kovacs等人（2012)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 109:12111)。经NIHAIDS 试剂项目，AIDS部门，NIAID,NIH:HIV-1gpl20mAb(VRC01)从JohnMascola处获得 VRC01(Wu等人（2010)Science. 329:856)。3BNC117 由MichelNussenzweig(洛克 菲勒大学（RockefellerUniversity),NewYork,NY)友情提供。PGT121 和PGT126 由 DennisBurton(斯克利普斯研究所（TheScrippsResearchInstitute),LaJolla,CA) 慷慨提供。2F5、4E10、PG9、PG16从市场上（PolymunScientific)获得。在4E10和2F5SPR 分析中用作阳性对照的GCNgp41_Inter(Frey等人（2010)Nat.Struct.Mol.Biol. 17:1486)由BingChen(波士顿儿童医院（Children'sHospitalBoston))友情提供。
[0169] 动物和免疫 在机构实验动物照料和使用委员会的批准的方法（IACUC)下将远系繁殖的雌性Hartley豚鼠（ElmHill) (n=5/组）安置在贝丝以色列女执事医疗中心动物研究所。在第 〇、4、8周，使用嵌合Μ或分化体Cgpl40Env蛋白三聚体（100Pg/动物）以500μL注射 体积分配在右四头肌和左四头肌之间对豚鼠进行肌内（i.m.)免疫。与蛋白共施用的佐剂 为前述的组合，所述组合包含15% (vol/vol)水包油Emulsigen(MVPLaboratories)/PBS 和 50μg的免疫刺激性双-核苷酸类型BoCpGDNA(5' -TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT-3'） (MidlandReagentCompany)(Kovacs等人（2012)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 109:12111)或基于ISC0M的基质M(Isconova,Sweden)。接收分化体C和嵌合Mgpl40 的混合物的动物组是这样的：各5(^g的分化体C和嵌合Mgpl40混合以使得每只动物被 施用总共100Kg的上述混合物。在每次免疫后四周从麻醉动物的腔静脉获得血清样品。
[0170] ELISA结合测