悬液加入培养皿中，补加6mL DMEM完全培养液，将培养皿置于5 % CO2、37°C培养箱中培养，培养3天后用于转染。
[0076]细胞转染
[0077]在24孔培养板上，按Lipofectamine 2000说明书进行操作，以利用Lipofectamine2000介导pGPU6/GFP/Neo转染到bMSCs作为对照组，每孔pGPU6/GFP/Neo加入量lyg、Lipofectamine 2000加入量IyL，设3个平行孔。将实施例的三维纳米纤维组织工程支架置入孔中，利用三维纳米纤维组织工程支架介导pGPU6/GFP/Neo转染到bMSCs作为实验组，每孔置入表面覆盖有三维纳米纤维组织工程支架的载玻片，三维纳米纤维组织工程支架的厚度为0.3mm左右，设3个平行孔。将传代培养的bMSCs胰酶消化，离心，计数，按每孔细胞数为IXlO5个接种到对照组和实验组的培养孔中，振荡数秒后，将24孔培养板放入5%CO2、37°C培养箱中培养，24h后每天观察，用倒置荧光显微镜检测核酸即pGPU6/GFP/Neo在细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。根据细胞生长情况和时间，适量补加含10%胎牛血清的完全培养基。结果如图4所不。
[0078]由图4可知，生长在三维纳米纤维组织工程支架的实验组bMSCs在28天内都可稳定、持续性表达绿色焚光蛋白(如图4中的Al、42、六3和六4所示。)，而利用Lipofectamine2000介导转染的对照组bMSCs的绿色焚光蛋白表达在7天后消弱，14天后消失(如图4中的B1、B2、B3和B4所示)。由此表明，本实施例的三维纳米纤维组织工程支架能够随着自身的缓慢降解而逐步释放携带pGHJ6/GFP/Ne0的壳聚糖纳米微囊，其介导pGPU6/GFP/Neo与细胞膜结合，使其转入胞内表达绿色荧光蛋白质，其在细胞内的表达时间更长，也就表明，本实施例的三维纳米纤维组织工程支架能够随着自身的缓慢降解而逐步释放携带的核酸的壳聚糖-核酸纳米微囊，介导核酸在受体细胞中长时程的发挥功能。
[0079](5)三维纳米纤维组织工程支架的细胞毒性检测
[0080]将本实施例制备的三维纳米纤维组织工程支架放入24孔培养板中作为实验组，以TCP处理的玻片爬片作为对照组(TCP)。将传代培养的兔骨髓间质干细胞胰酶消化，离心，计数，按每孔细胞数约为IXlO5个接种到实验组和对照组的培养孔中，振荡数秒后，将24孔培养板放入5 % C02，37°C培养箱中培养。然后分别于Id、3d、5d、7d天对实验组和对照组取样，每个时间点取3个样，通过四唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖情况。将培养到相应时间的24孔培养板移至超净工作台内，弃去旧培养液，用预热的PBS溶液冲洗3次，每孔加入空白培养基360μ1，随后加入40μ1 MTT，培养4小时，紫色沉淀产生，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入400μ1甲臜(Formazan)溶解液，避光振荡1min使结晶物充分溶解。吸取溶液加入96孔培养板中，每孔ΙΟΟμΙ，在570波长下用酶标仪测定各孔的OD值，细胞毒性小，细胞增殖越多越快，则OD值越高;细胞毒性越大，则OD值越低。每组设3复孔，并重复实验3次。结果如图5所不O
[0081 ]由图5可知，在Id、3d、5d时，实验组的细胞密度均低于对照组，但实验组的细胞增殖速率高于对照组，在7d时，实验组的细胞增值率与对照组已无明显差异。由此表明，本实施例的三维纳米纤维组织工程支架对细胞的毒性非常小，细胞在三维纳米纤维组织工程支架上能够稳定增殖。
[0082]综上所述，本发明实施例的三维纳米纤维组织工程支架制备方法能够制得三维纳米纤维组织工程支架，且制得的三维纳米纤维组织工程支架具有以下优点:(I)三维纳米纤维组织工程支架(以下简称支架)具有较高的孔隙率以及比表面积，由于采用丝素蛋白来作为支架的材料以及在支架表层和孔隙具有胶原，其具有较高的生物相容性以及机械性能，非常有利于细胞粘附和迀移，为细胞提供了良好的生长微环境，非常适用于肌腱和韧带等组织的再生修复，再配合其所携带的具有功能的核酸，调控细胞或受损组织细胞中相关基因的表达，确保了其治愈效果更明显。(2)相对于现有的口服或注射给药的基因治疗方式，使用该支架治疗时，可将该支架直接放置于受损组织部位，其更具有靶向性，避免了药物全身弥漫性的毒副作用。(3)此外，在该支架降解的过程中，其能够缓慢地释放出所包被的功能性的核酸。因此，核酸随着支架的降解而持续不断地从支架中转染进入到细胞或周围受损组织细胞中，这样使得核酸能够在受损组织中发挥功能的时间更具有持续性，时间更长，其克服了现有基因治疗技术中在非病毒载体在细胞中表达瞬时性的缺点和病毒载体的潜在致癌风险。
[0083]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种三维纳米纤维组织工程支架，其特征在于，其包括丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架，所述丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架由含有壳聚糖-核酸纳米微囊和丝素蛋白的纺丝溶液经纺丝工艺制成的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝交联制成。2.根据权利要求1所述的三维纳米纤维组织工程支架，其特征在于，所述壳聚糖-核酸纳米微囊中的核酸为质粒、siRNA或反义寡核苷酸片段，所述壳聚糖-核酸纳米微囊中的所述壳聚糖的分子量范围为50KDa?190KDa，脱乙酰度为75?85%。3.根据权利要求1所述的三维纳米纤维组织工程支架，其特征在于，还包括胶原包覆层，所述胶原包覆层包覆所述丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。4.一种三维纳米纤维组织工程支架的制备方法，其特征在于，其包括: 制备壳聚糖-核酸纳米微囊； 配置丝素蛋白溶液； 将所述壳聚糖-核酸纳米微囊加入到所述丝素蛋白溶液中形成纺丝溶液； 采用纺丝工艺对所述纺丝溶液进行纺丝，制得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝； 交联所述丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝，制得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。5.根据权利要求4所述的用作基因载体的三维纳米纤维组织工程的制备方法，其特征在于，配置所述丝素蛋白溶液包括:将丝素蛋白溶于甲酸或三氟乙酸溶液中，得到所述丝素蛋白溶液，所述丝素蛋白溶液的质量百分数为18?22%。6.根据权利要求4所述的三维纳米纤维组织工程的制备方法，其特征在于，制备所述壳聚糖-核酸纳米微囊包括:先将壳聚糖和核酸分别溶于乙酸钠缓冲溶液中，制得壳聚糖溶液和核酸溶液，再将所述壳聚糖溶液与所述核酸溶液分别加热并混合，得到含有所述壳聚糖-核酸纳米微囊的壳聚糖-核酸纳米微囊溶液，所述壳聚糖-核酸纳米微囊溶液中所述壳聚糖与所述核酸的质量比为1.8?2.2:1。7.根据权利要求6所述的三维纳米纤维组织工程支架的制备方法，其特征在于，将所述壳聚糖-核酸纳米微囊溶液与丝素蛋白溶液按体积比为0.1?0.12:1的比例混合，得到所述纺丝溶液。8.根据权利要求6所述的纳米纤维支架的制备方法，其特征在于，所述核酸为质粒、siRNA或反义寡核苷酸片段，所述壳聚糖的分子量范围为50KDa-190KDa，脱乙酰度为75?85%。9.根据权利要求4所述的三维纳米纤维组织工程支架的制备方法，其特征在于，对所述纺丝溶液进行纺丝包括:将所述纺丝溶液注射加入到静电纺丝装置进行纺丝，调节所述纺丝装置的电压为8?16KV、注射速度4?12yL/min、接收距离10?16cm，得到所述丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝。10.根据权利要求4所述的三维纳米纤维组织工程的制备方法，其特征在于，还包括将所述丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架浸泡在胶原溶液中培养包被，制得具有胶原包覆层包覆的所述丝素蛋白-壳聚糖核酸-纳米纤维支架。
【专利摘要】本发明公开了一种三维纳米纤维组织工程支架，其包括丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架，该丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架由含有壳聚糖-核酸纳米微囊和丝素蛋白的纺丝溶液经纺丝工艺制成的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝交联制成。此三维纳米纤维组织工程支架不仅能够为细胞提供良好的类似于细胞外基质的生长微环境和足够的力学支撑，而且能够缓慢地自然降解并释放出携带核酸的壳聚糖-核酸纳米微囊，壳聚糖-核酸纳米微囊又可以将其携带的核酸导入到细胞中，发挥局部靶向、时间可控的基因治疗作用。此外，本发明还公开了此三维纳米纤维组织工程支架的制备方法。
【IPC分类】A61K47/48, D04H1/728, D01F1/10, D01F4/00, D01D5/00, A61K48/00
【公开号】CN105497913
【申请号】CN201610094210
【发明人】银国利, 花扣珍, 傅晓斌, 蒋锦琴, 刘丹丹, 张琦
【申请人】浙江医学高等专科学校
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年2月19日