1.一种猪圆环病毒2型(PCV2)双拷贝感染性克隆在PCV2高免血清制备中的应用，该PCV2双拷贝感染性克隆经细胞转染、传代后经浓缩纯化用于制备PCV2高免血清，用于PCV2相关疾病的诊断和治疗。该猪圆环病毒2型双拷贝感染性克隆的拯救方法包括以下四个步骤：
步骤一：双拷贝感染性克隆pEGFP-N1-2PCV2的构建：
(1)PCV2DNA的提取
a、从临床PMWS症状猪群中分离得到PCV2毒株，对其进行基因比对和序列分析，取含PCV2-GD毒株的细胞培养物200μL，加入20μLProteinase K溶液，混匀；
b、加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，待溶液变清亮简短离心以去除管盖内壁的水珠，加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15秒，简短离心去除管壁盖内壁的水珠；
c、将上一步所得溶液加入到试剂盒配的吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前加入适量无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
d、向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW(使用前加入适量无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，该步骤重复两次，然后将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液，将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加60μL洗脱液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，收集病毒基因组DNA，-20℃保存备用；
(2)设计引物和选择酶切位点
第一对引物：GDF1：cg ctcgag gctggctgaacttttg，GDR1cga ccgcgg aaatttctgacaaacg，上游引物GDF1下划线部分是Xho I酶切位点，下游引物GDR1下划线部分是Sac II酶切位点；
第二对引物：GDF2：cat ccgcgg gctggctgaacca，GDR2 ca ggatccaaatttctgacaaacgttacaggg，上游引物GDF2下划线部分是Sac II酶切位点，下游引物GDR2下划线部分是BamH I酶切位点；
(3)全基因扩增
以上述DNA为模板，利用设计的2对PCR引物GDF1/GDR1，GDF2/GDR2分别扩增两个拷贝的PCV2全基因组片段(即片段B、D)；扩增条件为：95℃预变性4min，94℃变性1min，54℃退火1min30s，72℃延伸3min，30个循环，72℃延伸10min；PCR反应体系如下：高保真酶Primer STAR 1μL，10×Buffer 5μL，dNTP Mix 8μL，PCV2DNA 1μL，GDF1/GDF22.5μL，GDR1/GDR22.5μL，dd H2O 30μL，总共计50μL；
PCR结束后取5μL PCR产物在10g/L的琼脂糖凝胶上电泳检测；
(4)双拷贝全基因感染性分子克隆的构建
将纯化后的B片段与pEGFP-N1质粒用Xho I酶、Sac II酶进行同步双酶切，切胶回收后再将二者按一定比例相连，连接采用10μL体系：B片段4μL，双酶切的载体pEGFP-N1 1μL，连接酶Ligation High(含Buffer)5μL，随后转化到DH5α感受态细胞，涂卡那抗性板，筛选并提取阳性重组质粒pEGFP-N1-B，再用Sac II酶、BamH I酶将D片段和重组质粒pEGFP-N1-B进行同步双酶切，切胶回收后再将二者高效连接酶Ligation High按一定比例相连：D片段4μL，双酶切的载体pEGFP-N1-B 1μL，连接酶Ligation High(含Buffer)5μL，转化到DH5α感受态细胞，涂卡那抗性板，筛选并提取质粒pEGFP-N1-BD，经菌液PCR、 双酶切鉴定以及序列测定，最终成功构建双拷贝重组质粒pEGFP-N1-BD；
(5)重组质粒双酶切鉴定
pEGFP-N1-BD的双酶切体系如下：BamHI 2μL，XhoI 2μLBuffer(10×K)2μL，dd H2O 9μL，pEGFP-N1-BD 15μL，共计30μL；将上述组分充分混匀，置于37℃水浴锅内，酶切过夜，用1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测；
(6)测序鉴定
将酶切鉴定后的质粒进行测序；
(7)阳性重组质粒大量提取
将已构建好的双拷贝重组质粒pEGFP-N1-BD提取后测定浓度和纯度，于-20℃保存备用，具体提取步骤如下：
a、平衡柱子：向吸附柱CP6中加入2.5ml平衡液BL，8000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，取100ml过夜培养的已鉴定为阳性的菌液加入离心管，室温8000rpm离心3分钟收集细菌，尽量吸除上清，用干净的吸水纸吸去管壁上的水滴；
b、向留有菌体沉淀的离心管中加入8ml溶液P1(已加入适量RNaseA)，漩涡震荡以彻底悬浮细菌细胞沉淀，向离心管中加入8ml溶液P2，立即温和地上下翻转混匀，室温放置5分钟，向离心管中加入8ml溶液P4，立即温和地上下翻转混匀，待溶液出现白色分散絮状沉淀后室温放置10分钟左右，8000rpm离心10分钟，使白色沉淀离至管底，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中，慢慢推动推柄，滤液收集在干净的50ml干净的离心管中；
c、向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中，室温8000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中，向吸附柱中加入10ml漂洗液PW(已提前加入适量无水乙醇)， 8000rpm离心2分钟，该步骤重复2次，向吸附柱中加入3ml无水乙醇，室温8000rpm离心2分钟，倒掉废液；
d、将吸附柱重新放回收集管中，8000rpm离心5分钟，除去吸附柱中的残留漂洗液，吸附柱CP6置于一个干净的50ml收集管中，向吸附膜的中间部位滴加2ml洗脱液TB，室温放置5分钟，然后室温8000rpm离心2分钟，将50ml离心管中的洗脱液全部转移到一个干净的1.5ml离心管中，-20℃保存备用。
步骤二：PCV2感染性克隆在ST细胞上的转染、传代以及体外感染性鉴定
(1)重组质粒转染ST细胞
复苏并传代培养ST细胞，选用进入对数生长期的无PCV1污染的ST细胞用胰酶按常规方法消化，以1×106个细胞/mL接种6孔板，每孔2mL，37℃5％CO2培养箱中培养，待细胞铺满约90％时，通过脂质体Lipofectamine 2000介导转染无PCV1污染的ST细胞，具体转染步骤如下：
每孔吸取150μL OPTI-MEM与10μL脂质体Lipofectamine2000充分混匀后，再吸取150μLOPTI-MEM+3ug双拷贝重组质粒+3μL reagent plus；将上述两种溶液混合，室温下放置5min；与此同时，将6孔板中的细胞用无血清MEM轻轻洗涤两遍后，每孔加入2m1无血清培养基，随后将质粒/脂质体复合物逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在37℃、5％的CO2培养箱中培养5小时，同时设平行转染空载体pEGFP-N1作为阴性对照，6小时后，更换含10％血清的MEM，在37℃、5％的CO2培养箱中培养，期间每隔12小时置于荧光显微镜下观察转染是否成功，培养72小时后冻融收获细胞培养物，按照普通病毒培养的方法对其进行盲传；
(2)在ST细胞上的传代
构建好的重组质粒转染ST细胞72小时后，将病毒液反复冻融3次，离心 取上清，将正常ST细胞按1∶4比例传代后，用T25细胞培养瓶进行培养，每瓶9ml细胞悬液，再吸取1m1转染后培养72h收获的细胞培养物上清轻轻摇晃均匀，置于37℃、5％的CO2培养箱中培养，24h后弃掉细胞瓶中液体，用灭菌的PBS轻轻洗涤细胞表面2遍，换用2％胎牛血清的MEM营养液10ml，继续培养48h后病毒液反复冻融3次，离心取上清，将按此方法继续盲传；
(3)在ST细胞上的感染性鉴定
再借助间接免疫荧光的方法对病毒在ST细胞上能否稳定增殖进行检测，具体操作步骤如下：将收获的病毒液按10％的比例同步接种于消化好的ST细胞悬液，再接种于96孔细胞培养板，100μL/孔，24h后弃掉板内液体，37℃，5％CO2培养箱中继续培养48小时，甩弃板内液体，用PBS洗涤三遍，倒扣拍干孔内液体后再进行下面步骤：
a、固定：每孔加入100μL无水乙醇，先在室温放置15min，再4℃放置1h，弃掉孔内无水乙醇，拍干；
b、孵育一抗：用抗体稀释液将抗PCV2 Cap蛋白鼠源单抗PCV2-A按1∶1000的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，37℃孵育1h。弃掉一抗，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干；
c、孵育二抗：用抗体稀释液将FITC标记的羊抗鼠IgG按1∶500的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，包裹上锡箔纸避光，37℃避光孵育1h。弃掉二抗，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干；
d、染核：将DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)用灭菌水稀释到1ug/μL，充分混匀后每孔加入100μL，室温下作用5分钟后弃之，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干；
e、封片：每孔加入碳缓甘油100μL，倒置荧光显微镜下观察。
步骤三：拯救毒株各代次盲传病毒液PCR检测
收获每一代病毒液保存于-20℃冰箱，抽取部分代次病毒液提取DNA进行PCR检测。
步骤四：拯救毒株毒价的初步测定
抽取盲传收获的病毒液部分代次F5，F10，F15，F20，F25，F40，F60做间接免疫荧光实验，计算阳性细胞孔数，用Reed-Muench法计算半数细胞培养感染量进行检测：
a、将长成单层的ST细胞用0.25％的胰酶消化，分装到96孔细胞培养板，用维持液将待测病毒液以10倍倍比稀释后同步接种ST细胞，每个稀释度接种8孔细胞，每孔100μL，并留两列ST细胞做空白对照，37℃5％CO2中培养24h；
b、弃去96孔细胞培养板内的液体，用MEM细胞培养液轻轻洗涤细胞表面2次，加足维持液继续培养48h，每孔加入100μL无水乙醇，先在室温放置15min，再4℃放置1h，弃掉孔内无水乙醇，拍干；
c、用抗体稀释液将抗PCV2 Cap蛋白鼠源单抗PCV2-A按1∶1000的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，37℃孵育1h；弃掉一抗，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干，用抗体稀释液将FITC标记的羊抗鼠IgG按1∶500的比例稀释，充分混匀后每孔加入100μL，包裹上锡箔纸避光，37℃避光孵育1h；弃掉二抗，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干；
d、将DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)用灭菌水稀释到1ug/μL，充分混匀后每孔加入100μL，室温下作用5分钟后弃之，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，拍干；
e、每孔加入碳缓甘油100μL，倒置荧光显微镜下观察，以出现绿色荧光者为阳性，表示病毒在此孔得到扩增；记录每列中出现绿色荧光的孔数，按Reed-Muench法计算病毒的半数感染量(TCID50)。