用于检测和表征微生物的方法与流程

文档序号:11109601阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于检测和表征临床样品中的微生物的方法,所述方法包括:

a)将临床样品引入至含有培养基的第一培养器皿;

b(i))任选地在所述第一培养器皿中预培养所述临床样品;

b(ii))任选地从所述第一培养器皿移出临床样品/培养基混合物或在预培养的情况下临床样品培养物的部分,并将所述部分引入至含有培养基的第二培养器皿,并且任选地在所述第二培养器皿中预培养所述部分;

c)从所述第一和/或第二培养器皿移出试验等分试样,并在所述第一和/或第二培养器皿中培养或继续培养所述临床样品和/或部分;

d)从所述试验等分试样分离DNA;

e)在所述DNA上进行核酸试验以鉴别微生物以及检测在所述微生物中存在或不存在一种或多种遗传抗微生物剂耐药性标记物,其中所述核酸试验使用以下各项进行:

i)用于微生物鉴别的一种或多种核酸探针和/或引物,所述探针或引物能够特异性地杂交至或所述引物能够选择性地扩增作为给定微生物的认同式的核苷酸序列;和

ii)用于抗微生物剂耐药性标记物检测的一种或多种核酸探针和/或引物,所述探针或引物能够特异性地杂交至或所述引物能够选择性地扩增代表遗传抗微生物剂耐药性标记物的核苷酸序列;

并且检测所述探针和/或引物是否已杂交至所述DNA和/或所述引物是否已被延伸(例如已发生扩增反应);以及

f)如果在步骤(e)中鉴别出微生物,则在来自步骤(c)的所述经过培养的临床样品和/或部分上进行抗微生物剂敏感性试验,其中在所述抗微生物剂敏感性试验中的微生物生长通过评估生长或用于生长的标记物进行监测,并且其中在所述抗微生物剂敏感性试验中使用的抗微生物剂的类型和浓度由在步骤(e)中检测出的微生物的身份和抗微生物剂耐药性标记物确定,并且任选地在所述第一和/或第二培养器皿中继续培养所述临床样品和/或部分,或

g)如果在步骤(e)中没有鉴别出微生物株,则进一步培养所述临床样品和/或部分以使进一步的微生物鉴别和抗微生物剂敏感性试验能够进行,从而鉴别所述微生物并且确定其抗微生物剂耐药性分布。

2.根据权利要求1所述的方法,所述方法包括:

a)将临床样品引入至含有培养基的培养器皿;

b)任选地在所述培养器皿中预培养所述临床样品;

c)从所述培养器皿移出试验等分试样,并在所述培养器皿中培养或继续培养所述临床样品;

d)从所述试验等分试样分离DNA;

e)在所述DNA上进行核酸试验以鉴别微生物以及检测在所述微生物中存在或不存在一种或多种遗传抗微生物剂耐药性标记物,其中所述核酸试验使用以下各项进行:

i)用于微生物鉴别的一种或多种核酸探针和/或引物,所述探针或引物能够特异性地杂交至或所述引物能够选择性地扩增作为给定微生物的认同式的核苷酸序列;和

ii)用于抗微生物剂耐药性标记物检测的一种或多种核酸探针和/或引物,所述探针或引物能够特异性地杂交至或所述引物能够选择性地扩增代表遗传抗微生物剂耐药性标记物的核苷酸序列;

并且检测所述探针和/或引物是否已杂交至所述DNA和/或所述引物是否已被延伸(例如已发生扩增反应);以及

f)如果在步骤(e)中鉴别出微生物,则在来自步骤(c)的所述经过培养的临床样品上进行抗微生物剂敏感性试验,其中在所述抗微生物剂敏感性试验中的微生物生长通过评估生长或用于生长的标记物进行监测,并且其中在所述抗微生物剂敏感性试验中使用的抗微生物剂的类型和浓度由在步骤(e)中检测出的微生物的身份和抗微生物剂耐药性标记物确定,并且任选地在所述培养器皿中继续培养所述临床样品;或

g)如果在步骤(e)中没有鉴别出微生物株,则进一步培养所述临床样品以使进一步的微生物鉴别和抗微生物剂敏感性试验能够进行,从而鉴别所述微生物并且确定其抗微生物剂耐药性分布。

3.根据权利要求1所述的方法,所述方法包括:

a)将临床样品引入至含有培养基的第一培养器皿;

b(i))任选地在所述第一培养器皿中预培养所述临床样品;

b(ii))从所述第一培养器皿移出所述临床样品/培养基混合物或者在预培养的情况下所述临床样品培养物的部分,并将所述部分引入至含有培养基的第二培养器皿并且任选地在所述第二培养器皿中预培养所述部分;

c)从所述第二培养器皿移出试验等分试样,并在所述第二培养器皿中培养或继续培养所述部分;

d)从所述试验等分试样分离DNA;

e)在所述DNA上进行核酸试验以鉴别微生物以及检测在所述微生物中存在或不存在一种或多种遗传抗微生物剂耐药性标记物,其中所述核酸试验使用以下各项进行:

i)用于微生物鉴别的一种或多种核酸探针和/或引物,所述探针或引物能够特异性地杂交至或所述引物能够选择性地扩增作为给定微生物的认同式的核苷酸序列;和

ii)用于抗微生物剂耐药性标记物检测的一种或多种核酸探针和/或引物,所述探针或引物能够特异性地杂交至或所述引物能够选择性地扩增代表遗传抗微生物剂耐药性标记物的核苷酸序列;

并且检测所述探针和/或引物是否已杂交至所述DNA和/或所述引物是否已被延伸(例如已发生扩增反应);以及

f)如果在步骤e)中鉴别出微生物,则在来自步骤(c)的所述经过培养的部分上进行抗微生物剂敏感性试验,其中在所述抗微生物剂敏感性试验中的微生物生长通过评估生长或用于生长的标记物进行监测,并且其中在所述抗微生物剂敏感性试验中使用的抗微生物剂的类型和浓度由在步骤(e)中检测出的微生物的身份和抗微生物剂耐药性标记物确定,并且任选地在所述第二培养器皿中继续培养所述部分;或

g)如果在步骤(e)中没有鉴别出微生物株,则进一步培养所述临床样品和/或部分以使进一步的微生物鉴别和抗微生物剂敏感性试验能够进行从而鉴别微生物并且确定其抗微生物剂耐药性分布。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中微生物生长通过确定在样品中存在的微生物细胞物质的量进行评估。

5.根据权利要求4所述的方法,其中所述在样品中存在的微生物细胞物质的量通过确定微生物和/或微生物集落或聚集体的量和/或数目和/或尺寸进行确定。

6.根据权利要求4或5所述的方法,其中所述在样品中存在的微生物细胞物质的量通过成像确定。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法,其中所述在样品中存在的微生物细胞物质的量通过成像而测量微生物生物质的面积来确定。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中所述临床样品来自患有脓毒症、被怀疑患有脓毒症或处于脓毒症的风险的受试者。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述临床样品是血液或血液成分。

10.根据权利要求1或9中任一项所述的方法,其中所述培养器皿是血液培养瓶。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述培养基含有中和在所述临床样品中存在的任何抗微生物剂的存在的试剂。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中将微生物DNA选择性地从所述试验等分试样分离或富集。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法,还包括在步骤(d)之前或与步骤(d)同时地从所述试验等分试样分离微生物或在所述试验等分试样中富集微生物的步骤。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法,其中步骤(c)至(e)被重复一次或多次。

15.根据权利要求14所述的方法,其中步骤(c)至(e)在没有初始预培养步骤的情况下进行,并且如果在步骤(e)中没有鉴别出微生物,则在预培养步骤(b)之后重复步骤(c)至(e)。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中对步骤(e)(i)的所述探针或引物进行设计或选择以鉴别在引起脓毒症的微生物群组中的微生物。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法,其中在步骤(e)(i)和/或(ii)中使用PCR引物。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法,其中在步骤(e)(i)和/或(ii)中使用杂交探针。

19.根据权利要求18所述的方法,其中所述杂交探针是包含能够杂交至认同式或抗微生物剂耐药性标记物核苷酸序列的5’和3’末端的扣锁探针。

20.根据权利要求19所述的方法,其中通过滚环扩增(RCA)检测环化的扣锁探针。

21.根据权利要求20所述的方法,其中所述RCA是或包括环至环扩增(C2CA),其中RCA产物被裂解为单体,并且所述单体被环化并且用作用于进一步的RCA反应的模板。

22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法,其中RCA产物通过将所述RCA产物裂解为单体、将所述单体杂交到阵列上并且检测在所述阵列上的单体进行检测。

23.根据权利要求20所述的方法,其中RCA产物用显微镜或通过成像或在流式细胞仪类方法中进行检测。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法,其中在步骤(f)中,微生物生长通过直接检测微生物确定。

25.根据权利要求24所述的方法,其中所述微生物用染色剂标记并检测。

26.根据权利要求1至23中任一项所述的方法,其中在步骤(f)中,微生物生长通过间接检测微生物确定。

27.根据权利要求26所述的方法,其中利用杂交至所述微生物的基因组中的核苷酸序列的扣锁探针,通过RCA而扩增环化的探针并且检测和计数多联RCA产物进行所述间接检测。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法,其中对于步骤(e)的所述核酸试验,利用能够杂交至所述DNA的捕获探针使分离出的DNA固定化。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法,其中如果在步骤(e)中鉴别出单个微生物,则进行步骤(f)。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法,其中如果在步骤(e)中鉴别出两种以上的微生物,则进行步骤(g)。

31.一种用于检测和表征临床样品中的微生物的微生物检测装置,所述装置包括:

含有培养基并且被布置成容纳所述临床样品的第一培养器皿;

任选的容纳培养基的第二培养器皿;

任选的部分移出装置,其用于移出所述第一培养器皿的内容物的部分并将所述部分转移至所述第二培养器皿;

其中所述第一培养器皿用于培养所述临床样品;

并且其中所述第二培养器皿被布置成接收作为所述第一培养器皿的所述内容物的所述部分的临床样品/培养基混合物或临床样品培养物,并且被布置成培养所述部分,

所述装置还包括:

试验等分试样提取装置,其用于移出所述第一和/或第二培养器皿的所述内容物的部分以用作试验等分试样;和

DNA测试装置,其用于从所述试验等分试样分离DNA,并且在所述DNA上进行核酸试验以鉴别微生物以及检测在所述微生物中存在或不存在一种或多种遗传抗微生物剂耐药性标记物,其中所述DNA测试装置被布置成利用以下各项进行所述核酸试验:

i.用于微生物鉴别的一种或多种核酸探针或引物,所述探针或引物能够特异性地杂交至或所述引物能够选择性地扩增作为给定微生物的认同式的核苷酸序列;和

ii.用于抗微生物剂耐药性标记物检测的一种或多种核酸探针或引物,所述探针或引物能够杂交至或所述引物能够选择性地扩增代表遗传抗微生物剂耐药性标记的核苷酸序列;

并且检测所述探针或引物是否已杂交至所述DNA和/或所述引物是否已参与扩增反应;

其中所述微生物检测装置被布置成使得:如果通过所述DNA测试装置鉴别出所给定的微生物,则将在提取所述试验等分试样之后通过培养由所述第一和/或第二培养器皿产生的经过培养的临床样品和/或经过培养的部分转至抗微生物剂敏感性试验装置,用于通过评估生长或用于生长的标记物来监测微生物生长而在所述经过培养的临床样品和/或经过培养的部分上进行抗微生物剂敏感性试验,并且其中在所述抗微生物剂敏感性试验中使用的抗微生物剂的类型和浓度由通过所述DNA测试装置检测出的所述微生物的身份和抗微生物剂耐药性标记物确定;并且如果通过所述DNA测试装置没有鉴别出所给定的微生物,则所述微生物检测装置在所述第一和/或第二培养器皿中进一步培养所述临床样品和/或经过培养的部分以使进一步的微生物鉴别和抗微生物剂敏感性试验按顺序在另外的培养之后能够进行,从而鉴别所述微生物并且确定其抗微生物剂耐药性分布。

32.一种用于检测和表征临床样品中的微生物的微生物检测装置,所述装置包括:

含有培养基并且被布置成容纳所述临床样品的培养器皿;

试验等分试样提取装置,其用于移出所述培养器皿的内容物的部分以用作试验等分试样;其中所述培养器皿用于在提取所述试验等分试样之后,并且任选地在提取所述试验等分试样之前,培养所述临床样品;

DNA测试装置,其用于从所述试验等分试样分离DNA,并且在所述DNA上进行核酸试验以鉴别微生物以及检测在所述微生物中存在或不存在一种或多种遗传抗微生物剂耐药性标记物,其中所述DNA测试装置被布置成利用以下各项进行所述核酸试验:

i.用于微生物鉴别的一种或多种核酸探针或引物,所述探针或引物能够特异性地杂交至或所述引物能够选择性地扩增作为给定微生物的认同式的核苷酸序列;和

ii.用于抗微生物剂耐药性标记物检测的一种或多种核酸探针或引物,所述探针或引物能够杂交至或所述引物能够选择性地扩增代表遗传抗微生物剂耐药性标记的核苷酸序列;

并且检测所述探针或引物是否已杂交至所述DNA和/或所述引物是否已参与扩增反应;

其中所述微生物检测装置被布置成使得:如果通过所述DNA测试装置鉴别出所给定的微生物,则将在提取所述试验等分试样之后通过培养由所述培养器皿产生的经过培养的临床样品转至抗微生物剂敏感性试验装置,用于通过评估生长或用于生长的标记物来监测微生物生长而在所述经过培养的临床样品上进行抗微生物剂敏感性试验,并且其中在所述抗微生物剂敏感性试验中使用的抗微生物剂的类型和浓度由通过所述DNA测试装置检测出的所述微生物的身份和抗微生物剂耐药性标记物确定;并且如果通过所述DNA测试装置没有鉴别出所给定的微生物,则所述微生物检测装置在所述培养器皿中进一步培养所述临床样品以使进一步的微生物鉴别和抗微生物剂敏感性试验按顺序在进一步的培养之后能够进行,从而鉴别所述微生物并且确定其抗微生物剂耐药性分布。

33.一种用于检测和表征临床样品中的微生物的微生物检测装置,所述装置包括:

含有培养基并且被布置成容纳所述临床样品的第一培养器皿;

含有培养基的第二培养器皿;

部分移出装置,其用于移出所述第一培养器皿的内容物的部分并将所述部分转移至所述第二培养器皿;

其中所述第一培养器皿用于培养所述临床样品;

并且其中所述第二培养器皿被布置成接收作为所述第一培养器皿的所述内容物的所述部分的临床样品/培养基混合物或临床样品培养物,并且被布置成培养所述部分;

所述装置还包括:

试验等分试样提取装置,其用于移出所述第二培养器皿的内容物的部分以用作试验等分试样;和

DNA测试装置,其用于从所述试验等分试样分离DNA,并且在所述DNA上进行核酸试验以鉴别微生物以及检测在所述微生物中存在或不存在一种或多种遗传抗微生物剂耐药性标记物,其中所述DNA测试装置被布置成利用以下各项进行所述核酸试验:

i.用于微生物鉴别的一种或多种核酸探针或引物,所述探针或引物能够特异性地杂交至或所述引物能够选择性地扩增作为给定微生物的认同式的核苷酸序列;和

ii.用于抗微生物剂耐药性标记物检测的一种或多种核酸探针或引物,所述探针或引物能够杂交至或所述引物能够选择性地扩增代表遗传抗微生物剂耐药性标记的核苷酸序列;

并且检测所述探针或引物是否已杂交至所述DNA和/或所述引物是否已参与扩增反应;

其中所述微生物检测装置被布置成使得:如果通过所述DNA测试装置鉴别出所给定的微生物,则将在提取所述试验等分试样之后通过培养由所述第二培养器皿产生的经过培养的部分转至抗微生物剂敏感性试验装置,用于通过评估生长或用于生长的标记物监测微生物生长而在所述经过培养的部分上进行抗微生物剂敏感性试验,并且其中在所述抗微生物剂敏感性试验中使用的抗微生物剂的类型和浓度由通过所述DNA测试装置检测出的所述微生物的身份和抗微生物剂耐药性标记物确定;

并且如果通过所述DNA测试装置没有鉴别出所给定的微生物,则所述微生物检测装置在所述第一和/或第二培养器皿中进一步培养所述临床样品和/或培养部分以使进一步的微生物鉴别和抗微生物剂敏感性试验按顺序在另外的培养之后能够进行,从而鉴别所述微生物并且确定其抗微生物剂耐药性分布。

34.根据权利要求31、32或33所述的微生物检测装置,其中所述装置被布置成进行权利要求1至30中任一项所述的方法。

35.根据权利要求31至34中任一项所述的微生物检测装置,其中所述培养器皿是血液培养瓶。

36.根据权利要求31至35中任一项所述的微生物检测装置,其中所述培养基含有用于中和在所述临床样品中存在的任何抗微生物剂的存在的试剂。

37.根据权利要求31至36中任一项所述的微生物检测装置,其中所述DNA测试装置被布置成使用杂交探针。

38.根据权利要求37所述的微生物检测装置,其中所述杂交探针是包含能够杂交至认同式或抗微生物剂耐药性标记物核苷酸序列的5’和3’末端的扣锁探针并且所述DNA测试装置被布置成通过滚环扩增(RCA)而检测环化的扣锁探针。

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