一种角蛋白酶及其基因序列与应用方法与流程

本发明提供了一种基于宏基因组技术挖掘的角蛋白酶及其基因编码序列与应用方法。属于基因工程及酶工程
技术领域：
。
背景技术：
：角蛋白是一类主要存在于爬行动物、鸟类、两栖动物、哺乳动物的组织中具有结缔和保护功能的纤维状蛋白质，富含半胱氨酸，赖氨酸，脯氨酸和丝氨酸.角蛋白是羽毛，头发，指甲，角，蹄，骨头，皮草，爪子，兽皮，鸟喙，皮肤，羊毛，鳞屑，猪鬃的主要组成物质.由于角蛋白中含有较多起交联作用的的二硫键，所以具有较高的机械强度，不容易被降解，对胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的水解作用有很强的抵抗力.事实上，每年都有几千吨的羽毛被废弃，对环境造成了巨大的污染，因此找到一个快速、简单、廉价、绿色的降解方式成为了本领域的研究热点。角蛋白酶大多属于胞外的丝氨酸蛋白酶类，是一类比其他蛋白酶能更有效水解角蛋白等顽固蛋白质的酶.角蛋白酶同时具有二硫键还原酶和多肽水解酶的活性，能够特异性降解角蛋白。因此利用角蛋白酶降解羽毛等角蛋白废弃物既是一种环境友好型的生物处理过程，又可回收水解产物用作动物饲料，创造利益。目前已报道的天然角蛋白酶生产菌株的产量整体不高，且给角蛋白酶的分离提纯也带来了一定挑战.随着分子生物学与基因工程技术的快速发展，研究角蛋白酶基因在异源宿主的克隆和高效表达成为了当前本领域的发展趋势，Liu等将Bacilluslicheniformis中的角蛋白酶重组到枯草芽孢杆菌WB600中进行了高效的表达，并将其应用在羊毛纺织业中(LiuB.,etal,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology,2013,29(5):825-832)；HSIN-HUNGLIN等将绿脓假单胞菌中的角蛋白基因转入毕赤酵母并实现了成功表达，且未发生糖基化修饰(LinH.H.,JournalofAgricultural&FoodChemistry,2009,57(17):7779-7784)，该组还将此基因分别转入到枯草芽孢杆菌DB104和大肠杆菌AD494(DE3)pLsS中，均实现成功表达(LinH.H.,,JournalofAgricultural&FoodChemistry,2009,57(9):3506-11)；LianYang等构建了一个快速降解羽毛的菌株，他们通过将枯草芽孢杆菌SCK6角蛋白酶基因转入其亲缘菌株解淀粉芽孢杆菌K11中，实现了过量表达(YangL.,etal,JournalofAgricultural&FoodChemistry,2016,64(1):78–84)。目前国内角蛋白酶的研究多处于对菌株的分离、筛选、角蛋白酶的分离纯化以及理化性质的研究阶段，在分子生物学方面，相关基因的克隆与表达的研究还相对报道较少。本发明通过宏基因组技术得到了一种角蛋白酶及其编码基因，并对该角蛋白酶基因在异源宿主中进行了异源表达，研究了其酶学性质，考察了该酶的工业应用潜力，为未来角蛋白酶相关研究奠定了基础。虽然该段基因与NCBI数据库中已报道的Bacillustequilensis、Bacilluspumilus、Bacilluscirculans、Bacillussafensis等角蛋白酶编码基因具有较高的同源性，但是本发明所采用角蛋白酶与已报道同类酶表现出不同的酶学性质，该角蛋白酶的最适反应温度为55℃，最适反应pH为10.0；不同金属离子对酶活影响具有差异；该角蛋白酶基因编码的角蛋白酶表现出较好的表面活性剂耐受性；而且该酶具有较广泛的底物谱，低胶原活性，高角蛋白活性，表现出良好的应用前景。技术实现要素：本发明的目的是提供一种基于宏基因组技术挖掘的角蛋白酶及其基因编码序列与应用方法。提供包含本发明基因的质粒及包含该表达质粒的宿主细胞，以及利用该重组菌株表达生产角蛋白酶的方法。本发明的技术方案是：基于宏基因组技术，通过构建Fosmid文库筛选土壤宏基因组中的角蛋白酶基因。以土壤宏基因组为模板，建立基因文库，筛选获得目的角蛋白酶基因，根据测序结果进一步设计引物通过PCR技术扩增获得编码基因序列，电泳鉴定后回收纯化PCR产物并克隆至pMD19-T载体构建重组质粒，将重组质粒转化至E.coliJM109，挑取多个阳性转化子至LB液体培养基中(Ampr)37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后进行双酶切、PCR验证.将验证正确的重组质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与经同样双酶切的载体质粒进行连接，选择的载体质粒包括pET系列，pMA5，pWB系列，pPICZα，PIC9K，pDXW系列等。连接产物转化至宿主菌大肠杆菌感受态细胞中、但不局限于大肠杆菌，还包括丝状真菌，枯草芽孢杆菌，谷氨酸棒杆菌，钝齿棒杆菌，毕赤酵母，酿酒酵母等，经培养后实现角蛋白酶的高效表达。(1)宏基因组技术筛选角蛋白酶基因从皮革厂堆放皮毛的地方收集土样，提取样品总DNA，构建Fosmid文库，用牛奶平板进行初筛，以可溶性角蛋白为底物测定酶活，复筛阳性转化子，对表现出角蛋白酶活的转化子进行质粒提取并测序，获得角蛋白酶编码基因。(2)PCR扩增角蛋白酶基因以土壤宏基因组为模板，根据测序得到的核苷酸序列设计引物(P1、P2)，通过PCR扩增角蛋白酶的编码基因：引物P1：5’-CGCGGATCCTGAAAAAAGCTATATTGTTGG-3’(BamHⅠ)引物P2：5’-CCCAAGCTTCTCGAGTTAGTTAGAAGCTG-3’(HindⅢ)PCR扩增反应在50μL体系中进行，反应体系中加入25μLEx(Premix)，20μLddH2O，2μL模板DNA，上下游引物个1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化，回收产物克隆至pMD19-T载体构建重组克隆质粒，将质粒转化至E.coliJM109，挑取多个阳性转化子至LB液体培养基中(Ampr)37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后对质粒进行双酶切、PCR验证，验证正确的进行序列测定。(3)重组表达质粒的构建本研究表达质粒pET-28a(+)为例，该质粒带有T7启动子和6×His-tag标签，将pET-28a(+)质粒和验证正确的含有目的基因的重组克隆质粒同时用BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切，37℃酶切3h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物用T4DNA连接酶在16℃过夜连接，连接产物转化至E.coliJM109感受态细胞中，在含卡那霉素抗性(50mg/L)的LB培养过夜培养，挑取多个阳性转化子至含卡那霉素的LB液体培养基中在37℃，220rpm条件下培养10～12h后提取质粒并命名为pET-28a(+)-ker.(4)重组表达菌株的构建与筛选本研究以大肠杆菌为例，研究将重组质粒pET-28a(+)-ker经42℃热击90s转化至大肠杆菌宿主E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，在含卡那霉素抗性(50mg/L)的LB培养过夜培养，通过PCR验证筛选阳性转化子E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ker，接种至含卡那霉素抗性(50mg/L)的LB培养基中过夜培养。次日按1％接种量转接于50mL新鲜LB液体培养基(含Kanr50mg/L)，于37℃培养约3h，待OD600nm约为0.6～0.8时，加入0.5mM的诱导剂IPTG50μL，20℃诱导16h后，重组菌表现出角蛋白酶活性。(5)重组角蛋白酶的分离纯化将上述获得的重组菌发酵液在4℃,8,000rpm条件下离心20min，去掉上清收集菌体沉淀，菌体用10mLTris-HCl(pH9.0)缓冲液清洗一遍去除杂质，8,000rpm离心10min，再次去掉上清收集菌体沉淀，用5mLTris-HCl(pH9.0)缓冲液悬浮，制备成菌悬液.将菌悬液在置于冰水浴中利用细胞超声破碎仪进行超声破碎，条件为：200W功率下工作200个循环，每个循环工作3s停7s。取破碎样品结晶紫染色，进行镜检，直到显示细胞破裂完全为止。细胞裂解破在4℃,8,000rpm条件下离心30min，所得上清即为粗酶液。将无细胞抽提液用0.22μm水膜过滤，制备上样样品，将Ni-NTA琼脂糖凝胶柱用BindingBuffer(20mMNaH2PO4，500mMNaCl，10mM咪唑，8M尿素)冲洗10个柱床体积，流速为5mL/min，直至平衡；将待纯化样品上样，流速为1.5mL/min；用BindingBuffer再冲洗10个柱床体积，流速为5mL/min；用0-100％的ElutionBuffer(20mMNaH2PO4，500mMNaCl，500mM咪唑，8M尿素)进行线性洗脱，洗脱25个柱床体积，流速为5mL/min，洗脱过程实时监控UV280nm，收集洗脱峰样品，通过SDS-PAGE分析角蛋白酶纯化样品的分子量大小及纯度。(6)重组角蛋白酶的酶学性质研究A.重组角蛋白酶最适pH及pH稳定性的测定分别配制不同pH的100mM的B-R缓冲液，用不同pH的缓冲液配制1％的角蛋白溶液，并用不同pH缓冲液适当稀释酶液，然后在上述pH条件下测定酶活，以酶活最高者作为100％.取适量酶液分别用不同pH的缓冲液稀释至适当浓度，于40℃静置1h，按照酶活测定方法测定残余酶活力，考察该酶的pH稳定性.以静置0h的酶活作为100％.B.重组角蛋白酶最适温度及温度稳定性的测定将适量稀释的酶液分别于30、40、50、60、70、80℃温度条件下测定角蛋白酶活力，确定该酶的最适作用温度.以酶活最高者作为100％.取适量稀释的酶液分别置于30、40、50、60、70、80℃6个不同温度中保温30min，然后测定该温度下残余酶活性.以保温0min的酶活作为100％.C.金属离子对重组角蛋白酶酶活的影响在酶活测定反应体系中分别添加不同金属离子(Fe2+、Fe3+、Co2+、Ca2+、Ni2+、Na+、Cu2+、K+、Mg2+、Al3+、Ba2+、Zn2+、Sn2+、Sr2+、Ag+、Pb2+、La3+、Li+、Mn2+)，使其终浓度分别达到1mM，室温下放置30min，分别测定酶活力.未添加金属离子的反应管作为100％.将金属离子浓度加大到5mM，室温放置30min后，用相同方法测定酶活.未添加金属离子的反应管作为100％.D.蛋白酶抑制剂及表面活性剂对重组角蛋白酶酶活的影响在酶活测定反应体系中分别添加不同种类的蛋白酶抑制剂PMSF、EDTA、DTT、β-巯基乙醇以及不同种类的表面活性剂SDS、Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、TritonX-100、TritonX-114、H2O2使其终浓度分别达到1mM和1％(H2O2达到15％)，室温下放置30min，按照酶活测定方法分别测定酶活力.未添加化合物的反应管作为100％.E.底物特异性对酶活的影响在酶活测定反应体系中分别以羊毛、羽毛、头发、1％可溶性角蛋白、1％酪蛋白、0.5％BSA、2％明胶、2％胶原蛋白为底物测定酶活，以1％可溶性角蛋白酶活作为100％.(7)应用重组角蛋白酶进行羽毛降解分别称取0.5g羽毛置于250mL锥形瓶中，并编号1、2、3、4、5、6，每个锥形瓶中分别放入下列溶液：1号瓶：50mL去离子水；2号瓶：50mL重组角蛋白酶发酵浓缩液(～200U/mL)；3号瓶：1.43mg木瓜蛋白酶溶于50mL去离子水；4号瓶：4.2g胃蛋白酶溶于50mL去离子水；5号瓶：24.2mg中性蛋白酶溶于50mL去离子水；6号瓶：2mg胰蛋白酶溶于50mL去离子水；将以上6个锥形瓶分别置于40℃，220rpm条件的摇床中消化分解羽毛20h，观察羽毛降解情况。本发明的优点和有益效果：本发明提供了一种基于宏基因组技术挖掘的角蛋白酶及其基因编码序列与应用方法。它具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，全长1,152个核苷酸，编码384个氨基酸。以pET-28a(+)为表达质粒，E.coliBL21(DE3)为表达宿主，实现了该耐表面活性剂角蛋白酶基因的高效表达，重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ker表现出角蛋白酶活性，能有效的降解可溶性角蛋白、酪蛋白、羊毛、羽毛等底物，在角蛋白废弃物的生物降解、饲料、洗涤剂、材料、透皮药物中应用等领域具有良好的应用价值。且该角蛋白酶对表面活性剂表现出较好的耐受性。该角蛋白酶的最适反应温度为55℃，最适反应pH为10.0，酶活稳定性较好，重组菌发酵周期短，适合于工业化大规模的生产。附图说明图1是PCR扩增角蛋白酶编码基因核酸电泳图谱。M：5,000bpDNAMarker；泳道1：扩增得到的角蛋白酶基因。图2是重组角蛋白酶分离纯化前后的SDS-PAGE图谱。M：标准蛋白分子量；泳道a1为不含有目的基因的空质粒对照菌株无细胞抽提液；泳道a2为重组菌株的角蛋白酶无细胞抽提液；泳道b1为纯化后的角蛋白酶。图3为角蛋白酶的最适pH及pH稳定性。图4为角蛋白酶的最适温度及温度稳定性。图5为角蛋白酶的底物谱。1：2％胶原蛋白；2：2％明胶；3：2％酪蛋白；4：2％可溶性角蛋白；5：2％BSA；6：羊毛；7：羽毛；8：头发。图6为角蛋白酶及其他普通蛋白酶降解羽毛情况。A：去离子水；B：重组角蛋白酶发酵浓缩液；C：木瓜蛋白酶；D：胃蛋白酶；E：中性蛋白酶；F：胰蛋白酶。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不受这些实施例的限制。实施例1本实施例说明基于宏基因组技术筛选角蛋白酶基因的方法。从皮革厂堆放皮毛的地方收集土样，提取样品总DNA，构建Fosmid文库，用牛奶平板进行初筛；以可溶性角蛋白为底物测定酶活，复筛阳性转化子，对表现出角蛋白酶活的转化子进行质粒提取并测序，获得角蛋白酶编码基因。实施例2本实施例说明角蛋白酶编码基因的克隆方法。以土壤宏基因组为模板，根据测序得到的核苷酸序列设计引物(P1、P2)，通过PCR扩增角蛋白酶的编码基因：引物P1：5’-CGCGGATCCTGAAAAAAGCTATATTGTTGG-3’(BamHⅠ)引物P2：5’-CCCAAGCTTCTCGAGTTAGTTAGAAGCTG-3’(HindⅢ)PCR扩增反应在50μL体系中进行，反应体系中加入25μLEx(Premix)，20μLddH2O，2μL模板DNA，上下游引物个1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化，回收产物克隆至pMD19-T载体构建重组克隆质粒，将质粒转化至E.coliJM109，挑取多个阳性转化子至LB液体培养基中(Ampr)37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后对质粒进行双酶切、PCR验证，验证正确的进行序列测定。核酸电泳结果显示角蛋白酶基因序列得到有效的扩增(图1)。实施例3本实施例以pET-28a(+)为例说明重组表达质粒的构建过程。pET-28a(+)质粒带有T7启动子和6×His-tag标签，将pET-28a(+)质粒和验证正确的含有目的基因的重组克隆质粒同时用BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切，37℃酶切3h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物用T4DNA连接酶在16℃过夜连接，连接产物转化至E.coliJM109感受态细胞中，在含卡那霉素抗性(50mg/L)的LB培养过夜培养，挑取多个阳性转化子至含卡那霉素的LB液体培养基中在37℃，220rpm条件下培养10～12h后提取质粒并命名为pET-28a(+)-ker。实施例4本实施例以大肠杆菌为例说明重组表达菌株的构建与筛选方法。将重组质粒pET-28a(+)-ker经42℃热击90s转化至宿主菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，在含卡那霉素抗性(50mg/L)的LB培养过夜培养，通过PCR验证筛选阳性转化子E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-ker，接种至含卡那霉素抗性(10mg/L)的LB培养基中过夜培养。次日按1％接种量转接于50mL新鲜LB液体培养基(含Kanr50mg/L)，于37℃培养约3h，待OD600nm约为0.6～0.8时，加入0.5mM的诱导剂IPTG50μL，20℃诱导16h后，重组菌表现出角蛋白酶活性。实施例5本实施例说明角蛋白酶的分离纯化过程。将上述获得的重组菌发酵液在4℃,8,000rpm条件下离心20min，去掉上清收集菌体沉淀，菌体用10mLTris-HCl(pH9.0)缓冲液清洗一遍去除杂质，8,000rpm离心10min，再次去掉上清收集菌体沉淀，用5mLTris-HCl(pH9.0)缓冲液悬浮，制备成菌悬液.将菌悬液在置于冰水浴中利用细胞超声破碎仪进行超声破碎，条件为：200W功率下工作200个循环，每个循环工作3s停7s。取破碎样品结晶紫染色，进行镜检，直到显示细胞破裂完全为止。细胞裂解破在4℃,8,000rpm条件下离心30min，所得上清即为粗酶液。将无细胞抽提液用0.22μm水膜过滤，制备上样样品，将Ni-NTA琼脂糖凝胶柱用BindingBuffer(20mMNaH2PO4，500mMNaCl，10mM咪唑，8M尿素)冲洗10个柱床体积，流速为5mL/min，直至平衡；将待纯化样品上样，流速为1.5mL/min；用BindingBuffer再冲洗10个柱床体积，流速为5mL/min；用0-100％的ElutionBuffer(20mMNaH2PO4，500mMNaCl，500mM咪唑，8M尿素)进行线性洗脱，洗脱25个柱床体积，流速为5mL/min，洗脱过程实时监控UV280nm，收集洗脱峰样品，通过SDS-PAGE分析角蛋白酶纯化样品的分子量大小及纯度，结果显示角蛋白酶表观分子量大小约为27000道尔顿，达到电泳纯(图2)。实施例6本实施例说明角蛋白酶的催化特征。(1)分别用pH5～11的B-R缓冲液将酶液和底物稀释适当倍数测定酶活，该酶的最适反应pH值为10，在pH6～12范围内能达到最高酶活的70％～100％。于40℃静置1h后测定残余酶活力，该重组角蛋白酶在pH7～12的条件下比较稳定，可以保持80％左右的相对酶活(图3)。(2)将适当稀释的酶液分别置于30、40、50、60、70、80℃温度条件下测定角蛋白酶活力，该酶的最适反应温度为55℃。取适当稀释的酶液分别置于以上温度的水浴锅中保温30min，然后测定各个温度下的残余酶活性。该酶在40～60℃条件下酶活相对稳定，可以维持80％的相对酶活(图4)。(3)在酶活测定的反应体系中分别添加不同的金属离子使终浓度达到1mM，放置30min后，分别测定酶活力，结果如表1所示，与未添加任何金属离子的空白对照组相比，有7种金属离子(Ca2+、Mn2+、Ag+、Na+、Mg2+、Li+、Sn2+)对酶活具有促进作用，其中Ca2+离子对重组角蛋白酶的促进作用最明显，相对酶活达到266.4％；而Cu2+、Pb2+离子则明显抑制了酶活。表1金属离子对酶活的影响金属离子相对酶活(％)金属离子相对酶活(％)Fe2+76.5±3.1Cu2+—Fe3+24.2±4.2Na+161.5±3.5Ca2+266.4±3.6Co2+68.0±2.9Ba2+54.6±2.4Li+105.2±2.3Mn2+126.8±2.1Mg2+115.7±3.6K+60.3±3.9Sr2+96.7±1.7Al3+48.9±1.5Pb2+—Zn2+74.4±4.1Ni2+60.8±2.8La3+98.8±3.2Sn2+180.2±2.4Ag+129.5±2.5(4)在酶活测定反应体系中分别添加不同的蛋白酶抑制剂和表面活性剂，室温放置30min后分别测定酶活力.结果如表2所示，PMSF对该酶表现出完全抑制作用，说明该重组角蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶类；表面活性剂如吐温和曲拉通对重组角蛋白酶表现出促进作用，该酶在表面活性剂中表现出的良好稳定性，使其在洗涤剂领域有良好的应用前景。表2蛋白酶抑制剂和表面活性剂对酶活的影响试剂浓度相对酶活/％试剂浓度相对酶活/％PMSF1mM—Tween401％131.9±1.4EDTA1mM14.4±2.3Tween601％141.2±2.6DTT1mM19.8±3.1Tween801％128.0±2.1β-ME0.05％19.7±2.4TritonX-1001％113.7±1.4SDS1mM86.2±1.4TritonX-1141％157.7±3.1Tween201％130.8±3.2(5)分别以2％胶原蛋白、2％明胶、2％酪蛋白、2％可溶性角蛋白、2％BSA、羊毛、羽毛、头发作为底物测定酶活。与可溶性角蛋白相比，酪蛋白作为底物时表现出最高酶活，约为205U/mL，而胶原蛋白为底物时酶活较低，仅为27U/mL(图5)。因此可以看出该重组角蛋白酶有着广泛的底物谱，对不可溶性底物和可溶性底物均能利用，且胶原蛋白酶活较低，有利于其在医药行业的应用。实施例7本实施例说明应用重组角蛋白酶进行羽毛降解试验。分别称取0.5g羽毛置于250mL锥形瓶中，每个锥形瓶中依次加入50mL的去离子水，重组角蛋白酶发酵液，木瓜蛋白酶溶液，胃蛋白酶溶液，中性蛋白酶溶液，胰蛋白酶溶液，然后将以上6个锥形瓶置于40℃，220rpm条件的摇床中消化分解羽毛20h.结果如图6所示，重组角蛋白酶发酵液里的羽毛基本被降解完全，只剩少量羽轴，而去离子水以及其他蛋白酶类均未对羽毛起到降解作用，说明该酶在饲料行业具有良好的应用前景。同时也可应用于用于角蛋白类材料的生物制备中，或应用于洗涤行业、用于去除蛋白以及角蛋白类污渍，以及透皮药物中应用、主要用于水解去除表皮角蛋白以促进药物渗透吸收。本发明不限于这些公开的实施例，本发明将覆盖技术方案所描述的范围，以及权利要求范围的各种变形和等效变化，在不偏离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域技术人员容易实现的任何修改或改进均属于本发明所要求保护的范围。SEQIDNO:1SEQ:1152bp；Composition：339A;271C;252G;290T;0OTHERPercentage:29.4%A;23.5%C;21.9%G;25.2%T;0.0%OTHERMolecularWeight(kDa):ssDNA:355.49dsDNA:710.16ORIGIN1ATGTGCGTGAAAAAGAAAAATGTGATGACAAGTGTTTTATTGGCTGTCCCTCTTCTGTTT61TCAGCAGGGTTTGGAGGCTCCATGGCAAATGCCGAGACGGTCTCCAAAACAGATAGTGAA121AAAAGCTATATTGTTGGTTTTAAAGCCTCTGCCACCACAAACAGCTCTAAAAAACAAGCT181GTCATTCAAAATGGTGGAAAACTAGAAAAACAATACCGCCTCATTAATGCTGCACAAGTG241AAAATGTCCGAACAAGCCGCCAAAAAACTTGAACATGACCCTAGCATTGCTTACGTAGAA301GAAGACCATAAAGCAGAAGCATATGCACAAACCGTCCCTTATGGAATCCCTCAAATCAAA361GCTCCAGCTGTACACGCTCAAGGTTATAAAGGTGCTAATGTCAAAGTAGCTGTCCTTGAT421ACTGGAATCCACGCTGCACACCCTGATTTAAATGTTGCAGGCGGTGCGAGCTTCGTCCCT481TCAGAGCCAAATGCCACCCAAGACTTTCAATCACATGGAACTCACGTAGCTGGAACCATT541GCTGCCCTTGATAACACAATTGGTGTACTCGGGGTCGCTCCAAGCGCTTCCCTATATGCT601GTAAAAGTATTAGACCGCTATGGCGACGGACAATACAGCTGGATTATTAGCGGTATTGAA661TGGGCTGTAGCCAATAATATGGATGTCATCAATATGAGCTTAGGCGGACCAAGCGGTT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