一种利用ERECTA基因调控种子大小的方法与流程

本发明涉及基因技术和植物学领域，具体地说，涉及一种利用erecta基因调控种子大小的方法。

技术背景

植物的种子主要由胚胎、胚乳和种皮三部分结构构成，因此种子大小受胚胎、胚乳和珠被共同调节。种子大小的调控是一个重要的发育生物学问题，在进化上，种子大小是一项重要的选择性状，同时在农业生产中，种子大小又是一项重要的农艺性状，可以为农作物的分子育种和改良品种提供理论依据。近年来国内外已经报道了一些参与种子大小的调控基因，但是对于种子大小的决定机制还不是很清楚，因此，对植物种子大小的调控进行研究具有重要的理论和应用意义。

erecta基因是一个类受体激酶基因，广泛存在于各种植物中，可改良不同作物如水稻、玉米、大豆等农作物的抗热性，还参与调控植物的生物学过程，如气孔、花序发育等。然而，现有的对erecta基因的研究中尚未发现其参与调控种子大小。因此，对于利用erecta基因调控种子大小的方法进行研究具有重要的意义。

技术实现要素：

基于现有技术的不足，本发明提供一种利用erecta基因调控种子大小的方法，通过对erecta基因进行过表达可有效调节植物种子大小。

本发明为了实现上述目的所采取的技术方案是：

一种利用erecta基因调控种子大小的方法，其特征在于：通过对erecta基因进行过量表达以调控植物种子大小。

进一步地，上述方法包括以下步骤：

(1)转化载体的构建：以提取的植物dna为模板，根据erecta基因设计引物进行pcr扩增，获得gerecta片段；再通过gateway方法将gerecta片段克隆到目的载体上，获得重组载体；

(2)转化：将重组载体转化农杆菌gv3101，得到含有重组质粒的gv3101；利用含有重组质粒的gv3101对植物进行花序浸染转化，转化得到的植株培养至种子成熟，收取t1代转基因种子；

(3)阳性苗的筛选：对收取的t1代转基因种子进行抗性培养，筛选有目的蛋白表达的阳性苗，培养收取t2代转基因种子，在t2代中挑选阳性苗与非阳性苗分离比3:1的植株继续筛选，直到t3代纯合。

进一步地，步骤(1)中所述引物如下：

正向引物seqidno.2：5’-caccattcaaaaatccctctccaacatcataa-3’；

反向引物seqidno.3：5’-ctcactgttctgagaaataacttgtcca-3’。

进一步地，步骤(1)中所述gerecta片段大小为7563bp，包括erecta基因atg上游2037bp的启动子和5526bperecta基因。

进一步地，步骤(1)中所述gateway方法具体为：将获得的gerecta片段连入pcr8/gw/topota载体中，得到pcr8-gerecta入门载体；并且利用lr重组酶对pcr8-gerecta和双元载体pgwb4进行重组反应，得到pgwb4-gerecta重组载体。

进一步地，所述双元载体pgwb4的c端含有gfp标签；所述pgwb4-gerecta重组载体转化表达得到gerecta-gfp融合蛋白。

进一步地，步骤(3)中所述抗性为50μg/ml潮霉素。

进一步地，步骤(3)中通过westernblot利用anti-gfp检测gerecta-gfp融合蛋白的表达。

有益效果：本发明公开了一种利用erecta基因调控种子大小的方法，通过对erecta基因进行过量表达以调控植物种子大小。本发明对erecta基因atg上游2037bp的启动子以及5526bperecta基因进行克隆，通过gateway方法进行重组载体的构建，高效、快速地将gerecta克隆到双元载体pgwb4上；通过westernblot利用anti-gfp检测gerecta-gfp融合蛋白的表达，保证表达产物的快速、准确检出，阳性苗筛选到t3代纯合，保证结果的准确性，避免假阳性的干扰。

综上所述，本发明调控效果显著，结果准确可靠，调控方法操作简单、方便，可公式化，易于推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例col-0、er-105、er-ox的种子表型对比；

图2为本发明实施例col-0、er-105、er-ox种子面积和种子质量对比统计；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详述：

实施例

本发明以拟南芥为例，进行erecta基因在拟南芥中的过量表达。

1.转化载体的构建

首先，根据拟南芥erecta基因(基因号at2g26330，见序列表seqidno.1)设计如下引物：

正向引物seqidno.2：5’-caccattcaaaaatccctctccaacatcataa-3’；

反向引物seqidno.3：5’-ctcactgttctgagaaataacttgtcca-3’。

提取拟南芥col-0叶片中的dna作为模板，利用上述引物进行pcr扩增；扩增采用高保真性酶phusiondnapolymerase(thermolot00242505)，反应体系(50μl)如下：

循环程序为：98℃预变性1min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸5min30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

扩增得到的gerecta片段大小为7563bp，包括erecta基因atg上游2037bp的启动子和5526bperecta基因，不包括终止密码子。

进一步地，利用gateway方法将gerecta片段连入pcr8/gw/topota载体中，得到pcr8-gerecta入门载体。具体步骤如下：

1)对得到的pcr产物进行末端加“a”反应，即在pcr产物中按照每50μl体系加入0.4μleasytaqdnapolymerase，于pcr仪中72℃反应30min。

2)将加“a”后pcr产物连入pcr8/gw/topota载体中，所使用的pcr8/gw/topota载体为pcr^tm8/gw/topotacloningkit。

反应体系(1.5μl)如下：

加“a”后pcr产物1μl；

saltsolution0.25μl；

pcr8/gw/topota载体0.25μl；

于22℃下，过夜连接。

3)第二天，将反应产物转化trans5α大肠杆菌感受态；转化的具体步骤如下：

取trans5α大肠杆菌感受态在冰上化冻；将感受态加入到过夜连接的反应产物中，轻轻的搅拌均匀，放在冰上，冰浴30min；置于金属浴上，42℃，热激90s，冰浴2min；于超净环境下，向热激后的感受态中加入400μl无抗lb溶液，将ep管置于37℃摇床，150rpm/min慢摇1h；将培养得到的感受态lb混合液体涂在含有相应抗性(spec抗性)的lb固体培养基平板上，密封后置于37℃培养箱，过夜倒置培养。

得到pcr8-gerecta入门载体后，利用lr重组酶对pcr8-gerecta和c端含有gfp标签的双元载体pgwb4进行重组反应，得到pgwb4-gerecta重组载体，pcr8-gerecta入门载体和pgwb4-gerecta重组载体均经测序验证。

lr重组使用invitrogen公司的gatewaylrclonaseiienzymemix，反应体系如下：

22℃下，过夜连接；第二天，将反应产物转化trans5α大肠杆菌感受态。

2.转化

将pgwb4-gerecta重组载体转化农杆菌gv3101，具体操作过程如下：

用无水乙醇冲洗电击杯，在超净工作台吹干后放在冰上冰浴30min；将农杆菌置于冰上化冻，吸取50μl农杆菌加入0.5μlpgwb4-gerecta重组质粒，冰浴30min；如质粒浓度小于100ng/μl，则添加质粒1μl。进一步地，将农杆菌与质粒的混合液加入电击杯，并将电击杯放入电击仪，调至bacteria-agro模式，电压2.2kv，电流6.1ms；电击后，将电击杯放回冰上，吸出电击杯中的液体置于ep管中，加入400μllb液体培养基，于30℃摇床150rpm/min慢摇1h。将培养得到的感受态lb混合溶液涂在含有相应抗性(kana&rif)的lb固体培养基平板上，密封后置于30℃培养箱，倒置培养3-4天，得到含有重组质粒的农杆菌，对农杆菌进行收集，洗涤。

进一步地，配置转化介质，称取ms2.165g，浓度为5％的蔗糖50g，mes0.5g，浓度为1mg/ml的6-ba10μl，用koh调ph至5.7—5.8，然后定容到1l，加入silwet100μl。使用配置好的转化介质将农杆菌重悬，倒入大小合适的烧杯中，将处于开花期的6周左右的拟南芥col-0花序浸入转化介质中5min；然后将农杆菌浸染过的拟南芥横躺放置在22℃培养室中，并用黑袋子遮光进行暗处理；暗处理1-2d后将其正常竖直放置于22℃光照培养室中培养，待种子成熟后，收取t1代转基因种子，进行后续的筛选。

3.阳性苗的筛选

将收取的t1代转基因的种子干燥后熟1周左右，对其进行消毒，并撒于添加有50μg/ml潮霉素的1/2ms培养基中，4℃纯化2-3d，潮霉素可以抑制非阳性苗的根的生长，进而对阳性苗进行初步筛选。将生根的阳性苗转移至22℃培养箱中培养10d左右，挑选长根的小苗移到营养土中继续培养，待培养4周左右提取叶片中的蛋白，通过westernblot利用绿色荧光蛋白抗体anti-gfp检测gerecta-gfp融合蛋白的表达。

选取有gerecta-gfp融合蛋白表达的阳性苗继续筛选，在t2代中挑选阳性苗和非阳性苗的分离比符合3：1的植物继续筛选，直到t3代纯合，选取表达量合适的并且gerecta基因是单拷贝插入的植物进行后续的表型观察和统计。

将筛选得到的t3代gerecta-gfp转基因阳性纯合植株er-ox分别与拟南芥生态型col-0以及拟南芥生态型col-0中的erecta缺失突变体er-105同时种下，在22℃培养室培养，光周期16l/8d，期间不受干旱、虫害等任何胁迫，直到种子成熟。收取成熟的种子后熟干燥一周左右，进行表型统计，实验重复3次，结果取平均值。

如图1、2所示，er-105的种子明显小于野生型col-0，其中er-105种子面积相比于col-0减小10％，种子重量减小12％，由此可见，erecta基因缺失之后会导致植物种子变小。相反，当过量表达erecta时，种子明显变大，er-ox与col-0相比种子面积增加了16％，种子重量增加了48％。综上所述，erecta基因的缺失和过表达直接影响种子大小，通过erecta基因的过量表达可增加种子的面积和重量，进而为改良农作物品质和产量奠定基础。

进一步地，erecta基因的过量表达可以应用于水稻、玉米、大豆等农作物种子大小的调控。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限制于本文所示的实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干修改和润饰也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>河北师范大学

<120>一种利用erecta基因调控种子大小的方法

<160>3

<170>patentinversion3.3

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