本发明涉及表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株，还涉及所述重组猪瘟兔化弱毒疫苗株在制备防控猪瘟和猪圆环病毒病的二价疫苗中的应用，属于表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株的构建领域。
背景技术：
：：猪瘟(classicalswinefever，csf)是由猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，csfv)引起的一种严重危害养猪业的烈性传染病。临床上主要以高热稽留、广泛性出血和高死亡率为主要特征。世界动物卫生组织(oie)将其列入须申报的oie疫病名录。在中国，csf被列为“一类动物疫病”，也是各国防控和检疫的重要传染病，在《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中将其列为五种优先防治的一类动物疫病之一。尽管美国、加拿大和新西兰等部分发达国家消灭了该病，但它仍是世界和中国养猪业的重要威胁。csfv是有囊膜的单股正链rna病毒，为黄病毒科瘟病毒属成员，基因组长约12.3kb，含有一个开放阅读框(orf)，在宿主和病毒酶系统的作用下，形成4种结构蛋白(c、erns、e1和e2)和8种非结构蛋白(npro、p7、ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b)(heimann,m.,roman-sosa,g.,martoglio,b.,thiel,h.j.,rümenapf,t.coreproteinofpestivirusesisprocessedatthecterminusbysignalpeptidepeptidase.j.virol.2006,80:1915-1921；gottipati,k.,ruggli,n.,gerber,m.,tratschin,j.d.,benning,m.,bellamy,h.,choi,k.h.thestructureofclassicalswinefevervirusnpro:anovelcysteineautoproteaseandzinc-bindingproteininvolvedinsubversionoftypeiinterferoninduction.plospathog.2013,9:e1003704；rümenapf,t.,stark,r.,heimann,m.,thiel,h.j.n-terminalproteaseofpestiviruses:identificationofputativecatalyticresiduesbysite-directedmutagenesis.j.virol.1998,72:2544-2547.)。猪圆环病毒病(porcinecircovirus-associateddisease，pcvad)是由猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，pcv2)引起的一种复杂的传染病。pcv2主要侵害免疫系统，降低机体的抵抗力和免疫应答反应，导致猪只继发感染其它病原微生物，从而使死亡率明显上升。该病可导致猪断奶后多系统综合症、皮炎和肾病综合症、繁殖障碍、肠道疾病、仔猪先天性震颠、仔猪渗出性皮炎及混合感染等相关性疾病，给全球养猪业造成了巨大的危害。根据基因组序列不同，pcv2分为pcv2a、pcv2b和pcv2c三个基因型(dupont,k.,nielsen,e.o.,baekbo,p.,larsen,l.e.genomicanalysisofpcv2isolatesfromdanisharchivesandacurrentpmwscase-controlstudysupportsashiftingenotypeswithtime.vet.microbiol.2008,128:56-64.)。近年来，随着养猪规模的扩大，csf的流行和发病特点以及表现形式也发生了很大变化，急性和典型性csf病例在逐渐减少，多以非典型性、慢性及隐性csf形式出现。研究发现，csfv常与其它病毒性、细菌性或寄生虫性病原混合感染。其中尤其与pcv2、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、伪狂犬病病毒(prv)等病原体混合感染最常见(ge,x.,wang,f.,guo,x.,yang,h.porcinecircovirustype2anditsassociateddiseasesinchina.virusres.2012,164:100-106.)。猪群感染pcv2后，不仅可直接危害猪只健康，还可侵害猪只的免疫系统，造成免疫抑制，降低其对csfv等病原体的抵抗力和对疫苗的反应性(王洪光,汤德元,罗险峰,曾智勇,李春燕,甘振磊,王凤,刘建,郝飞.猪瘟与其他疫病混合感染情况的研究进展.猪病防控.2013,4:56-58；huang,y.l.,pang,v.f.,lin,c.m.,tsai,y.c.,chia,m.y.,deng,m.c.,chang,c.y.,jeng,c.r.porcinecircovirustype2(pcv2)infectiondecreasestheefficacyofanattenuatedclassicalswinefevervirus(csfv)vaccine.vet.res.2011,42:115.)。猪瘟兔化弱毒疫苗株(c株或hclv株)是中国学者在二十世纪50年代通过将csfv强毒株在兔体内连续传480余代后培育而成的一株优异的高效弱毒疫苗，可同时诱导体液免疫和细胞免疫(周泰冲.猪瘟病毒与防制猪瘟的研究进展.兽医科技杂志.1980,4:25-35；仇华吉,童光志,沈荣显.猪瘟兔化弱毒疫苗半个世纪的回顾.中国农业科学.2005,38:1675-1685.)。用c株接种猪只后2～4d，即能对不同基因型的csfv均能提供有效保护(ferrari,m.atissueculturevaccinewithlapinizedchinese(lc)strainofhogcholeravirus(hcv).comp.immunol.microbiol.infect.dis.1992,15:221-228；kaden,v.,renner,c.,rothe,a.,lange,e.,a.,gossger,k.evaluationoftheoralimmunisationofwildboaragainstclassicalswinefeverinbaden-wurttemberg.berl.munch.tierarztl.wochenschr.2003,116:362-367.)。因此，从安全性和免疫原性上看，c株具有作为活病毒载体的潜力和优势，如果能以csfvc株为基础构建能同时诱导抗csfv抗体与抗pcv2cap抗体的重组c株，将为研制防控猪瘟和猪圆环病毒病的二价疫苗奠定基础。已有文献报道，在npro蛋白中插入外源基因对csfv生长特性影响较小，但并没有文献报道在csfvnpro和c蛋白之间是否可以允许外源基因的插入以及插入外源基因是否影响csfv的生长特性。技术实现要素：本发明所要解决的第一个技术问题是以csfvc株为基础，构建能同时诱导抗csfv抗体与抗pcv2cap抗体的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株，所述重组猪瘟兔化弱毒疫苗株能够稳定表达分泌型pcv2cap蛋白，并且能够同时诱导家兔产生抗csfv和抗pcv2cap的抗体；本发明所要解决的第二个技术问题是将所述的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株应用于制备防控猪瘟和猪圆环病毒病的二价疫苗。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：本发明以猪瘟兔化弱毒株(c株)为活病毒载体，在csfvc株npro和c基因之间引入去除核定位信号并在n端加有分泌信号肽的猪圆环病毒2型cap蛋白基因，构建了表达分泌型猪圆环病毒2型cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株，能同时诱导抗csfv抗体与抗pcv2cap抗体。具体的，本发明在猪瘟兔化弱毒株(c株)基因组的基础上，构建重组感染性克隆phclv-uspcap和phclv-pspcap。为了使cap蛋白分泌到细胞外，本发明将cap基因去除核定位信号(nuclearlocationsignal,nls)(n端前41个aa)，并在n端引入泛素特异性肽酶(ubiquitinspecificpeptidase)基因的信号肽后(所述泛素特异性肽酶基因的信号肽的氨基酸序列为seqidno.11所示)，并在此cap基因的n端引入npro蛋白的自切割识别位点(猪瘟病毒c蛋白前7个氨基酸序列，7-aalinker，其氨基酸序列为seqidno.9所示)，c端引入猪捷申病毒1型2a(porcineteschovirus12a，p2a)切割序列(其氨基酸序列为seqidno.10所示)，以便利用npro蛋白和p2a的切割功能，以单独表达分泌型cap蛋白。本发明通过重叠pcr将优化的cap基因插入到c株基因组中npro和c蛋白编码基因之间，然后将pcr产物用标准分子克隆技术获得重组感染性克隆phclv-uspcap。用与phclv-uspcap相同的构建策略，本发明将核定位信号替换为催乳素(prolactin)基因的信号肽(所述催乳素基因的信号肽的氨基酸序列为seqidno.13所示)，获得重组感染性克隆phclv-pspcap。本发明将重组感染性克隆phclv-uspcap和phclv-pspcap分别转染sk6细胞，成功拯救获得单独表达分泌型cap蛋白的重组病毒rhclv-uspcap和rhclv-pspcap。本发明将表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株rhclv-uspcap提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：cgmccno.14321；分类命名为：表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2017年7月3日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明将表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株rhclv-pspcap，提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：cgmccno.14322；分类命名为：表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2017年7月3日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。猪瘟病毒抗原检测elisa检测结果显示，本发明所拯救的第8代到第10代重组病毒rhclv-pspcap和rhclv-uspcap的erns蛋白抗原为阳性。测序结果表明，本发明已成功在重组病毒基因组中引入cap基因，而且插入的cap基因不存在任何突变。间接免疫荧光检测结果显示，用鼠源抗cap单抗检测到感染重组病毒的细胞质中产生特异性荧光，证实两株重组病毒均能表达去除nls的cap蛋白。生长动力学分析结果表明，两株重组病毒和亲本病毒具有相似的生长特性，表明外源cap基因的插入并不影响重组病毒的生长能力。遗传稳定性分析表明，在第15代到第20代重组病毒的每代病毒中均可扩增到预期大小一致的目的基因；测序结果显示，cap基因在各代重组病毒的基因组中均保持完整性和正确性。以上结果证实，重组病毒rhclv-pspcap和rhclv-uspcap经细胞传代可保持遗传稳定性。重组病毒在家兔体内的生物学特性分析结果表明，重组病毒rhclv-pspcap和rhclv-uspcap接种家兔后均能诱导家兔产生定型热反应，并且在家兔脾脏中分离到重组病毒，插入的外源cap基因在重组病毒中保持正确性和完整性。免疫原性分析结果表明，本发明所述的2株重组病毒能够诱导家兔同时产生高水平的抗csfv特异性抗体和抗pcv2cap蛋白的抗体。已有文献报道，在npro蛋白中插入外源基因对csfv生长特性影响较小，但在csfvnpro和c蛋白之间是否可以允许外源基因的插入以及插入外源基因是否影响csfv的生长特性，并没有文献报道。本发明人实验室前期研究中，在csfvc株npro和c蛋白之间引入pcv2cap基因，成功构建重组病毒rhclv-2acap。该重组病毒利用npro蛋白的自切割功能和p2a的切割功能，以单独形式表达cap蛋白。试验证明，重组病毒rhclv-2acap在接种家兔后10d能诱导家兔产生较高水平抗csfve2的特异性抗体，然而在家兔体内未能检测到抗pcv2cap蛋白的特异性抗体。外源蛋白不能诱导特异性抗体产生的原因有很多，可能是表达量较少，也可能是蛋白表达形式的不同。前期试验结果表明，rhclv-2acap表达的cap蛋白定位在细胞核。因此，rhclv-2acap表达的cap蛋白不能分泌到细胞外是导致重组病毒不能诱导家兔产生抗cap抗体的主要原因。为了实现pcv2cap蛋白的分泌表达，本发明去除cap蛋白的核定位信号，并在其n端引入分泌信号肽，将优化后的cap基因重新插入到c株基因组中npro和c蛋白之间拯救重组病毒。为了增加cap蛋白分泌到细胞外的可能性，本发明选取了两种不同的分泌信号肽，分别为泛素特异性肽酶(ubiquitinspecificpeptidase)基因的信号肽和催乳素(prolactin)基因的信号肽，分别成功拯救获得重组病毒rhclv-uspcap和rhclv-pspcap。2株重组病毒可以稳定表达cap基因且保持亲本病毒的生长特性，并能够诱导家兔同时产生抗csfve2抗体和抗pcv2cap抗体，为研制能够同时抵抗猪瘟和猪圆环病毒病的二价疫苗奠定了基础。本发明进一步公开了所述的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株rhclv-uspcap或rhclv-pspcap在制备预防猪瘟(classicalswinefever，csf)或猪圆环病毒病(porcinecircovirus-associateddisease，pcvad)中任意一种或两种的试剂或药物中的应用。本发明还公开了所述的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株rhclv-uspcap或者rhclv-pspcap在制备预防猪瘟和猪圆环病毒病的二价疫苗中的应用。本发明还公开了一种同时预防猪瘟和猪圆环病毒病的二价疫苗，包括：预防上有效量的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株rhclv-uspcap或预防上有效量的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株rhclv-pspcap。其中，所述二价疫苗中还可以包括药学上可接受的佐剂。本发明还公开了一种制备重组猪瘟兔化弱毒疫苗株rhclv-uspcap的方法，包括以下步骤：(1)将猪圆环病毒2型cap蛋白的核定位信号(n端前41个氨基酸)替换为泛素特异性肽酶基因的信号肽，并在cap蛋白的n端引入猪瘟病毒c蛋白的前7个氨基酸，在c端引入猪捷申病毒1型2a切割序列；将优化的cap蛋白编码基因插入到猪瘟兔化弱毒疫苗株c株基因组中npro和c蛋白编码基因之间，获得重组感染性克隆phclv-uspcap(重组感染性克隆phclv-uspcap的构建策略见图1b)；(2)将重组感染性克隆phclv-uspcap转染sk6细胞，拯救重组病毒，即得。其中，步骤(1)通过重叠pcr将优化的cap蛋白编码基因插入到猪瘟兔化弱毒疫苗株c株基因组中npro和c蛋白编码基因之间；所述重叠pcr的引物包括：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列。所述猪瘟病毒c蛋白的前7个氨基酸的序列为seqidno.9所示；所述猪捷申病毒1型2a切割序列的氨基酸序列为seqidno.10所示；所述泛素特异性肽酶基因的信号肽的氨基酸序列为seqidno.11所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.12所示；所述去除核定位信号的猪圆环病毒2型cap蛋白的氨基酸序列seqidno.15所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.16所示。本发明还公开了一种制备所述重组猪瘟兔化弱毒疫苗株rhclv-pspcap的方法，包括以下步骤：(1)将猪圆环病毒2型cap蛋白的核定位信号(n端前41个氨基酸)替换为催乳素基因的信号肽，并在cap蛋白的n端引入猪瘟病毒c蛋白的前7个氨基酸，在c端引入猪捷申病毒1型2a切割序列；将优化的cap蛋白编码基因插入到猪瘟兔化弱毒疫苗株c株基因组中npro和c蛋白编码基因之间，获得重组感染性克隆phclv-pspcap(重组感染性克隆phclv-pspcap的构建策略见图1c)；(2)将重组感染性克隆phclv-pspcap转染sk6细胞，拯救重组病毒，即得。其中，步骤(1)通过重叠pcr将优化的cap蛋白编码基因插入到猪瘟兔化弱毒疫苗株c株基因组中npro和c蛋白编码基因之间；所述重叠pcr的引物包括：seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8所示的核苷酸序列。所述猪瘟病毒c蛋白的前7个氨基酸的序列为seqidno.9所示；所述猪捷申病毒1型2a切割序列的氨基酸序列为seqidno.10所示；所述催乳素基因的信号肽的氨基酸序列为seqidno.13所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.14所示；所述去除核定位信号的猪圆环病毒2型cap蛋白的氨基酸序列seqidno.15所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.16所示。本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：本发明首次以猪瘟兔化弱毒疫苗c株为活病毒载体，在c株npro和c蛋白之间引入去除nls并在n端加有分泌信号肽的pcv2cap基因，成功构建了单独表达分泌型cap蛋白的2株重组c株rhclv-uspcap和rhclv-pspcap。本发明所述的2株重组病毒可以诱导家兔产生定型热反应并在家兔脾脏中复制；重要的是，2株重组病毒能够诱导家兔同时产生抗csfv抗体和抗pcv2抗体。本发明构建的表达pcv2cap蛋白的2株重组c株，在开发同时防控猪瘟和猪圆环病毒病的二价疫苗中具有重要潜力。附图说明图1为全长感染性克隆phclv-uspcap和phclv-pspcap的构建策略；其中，a：猪瘟兔化弱毒株基因组模式图；b：rhclv-uspcap基因组的模式图，将cap基因去除核定位信号(n端前41个aa)，并在n端引入泛素特异性肽酶(ubiquitinspecificpeptidase)基因的信号肽后，并在此cap基因的n端引入猪瘟病毒c蛋白前7个氨基酸序列(7-aalinker)，c端引入猪捷申病毒1型2a(porcineteschovirus12a，p2a)切割序列，箭头表示切割位点；c：rhclv-pspcap基因组的模式图，将cap基因核定位信号替换为催乳素(prolactin)基因的信号肽；图2为重组病毒抗原捕获elisa的检测；其中，cutoff即判断结果的临界值；positive为阳性对照；negative为阴性对照；图3为ifa检测重组病毒cap蛋白的表达；其中，merge为不同颜色荧光图片的叠加；mock为空白对照；图4为重组病毒的生长曲线；图5为rt-pcr检测外源基因在重组病毒中的遗传稳定性；其中，a：rhclv-uspcap；b：rhclv-pspcap；图6为从家兔脾脏中分离病毒的elisa(a)和rt-pcr(b)检测；其中，cutoff为判断结果的临界值；positive为阳性对照；negative为阴性对照。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。实施例1表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株的构建及其在家兔体内的免疫原性评价1、材料和方法1.1质粒、细胞和病毒猪瘟兔化弱毒c株疫苗(批号2015015)和猪圆环病毒2型灭活疫苗(lg株)由哈尔滨维科公司提供；csfvc株的感染性克隆pcsfv-hclv及由其拯救的病毒rhclv、包含p2a和pcv2cap基因的感染性克隆phclv-2acap和质粒pmd18t-simple-vp2-2a-cap由本实验保存。sk6用含5％胎牛血清的dmem培养基(不含bvdv和bvdv抗体)培养，并放置于含5％co2的37℃的温箱中。1.2感染性克隆phclv-uspcap和phclv-pspcap的构建本发明在c株基因组的基础上(图1a)，构建重组感染性克隆phclv-uspcap(图1b)和phclv-pspcap(图1c)。为了使cap蛋白分泌到细胞外，将cap蛋白的核定位信号(n端前41个氨基酸)替换为分泌信号肽，并将此cap基因的n端引入npro蛋白的自切割识别位点(c蛋白的前7个氨基酸)，在c端引入p2a切割序列，以便利用npro蛋白和p2a的切割功能，以单独表达分泌型cap蛋白(其中，去除核定位信号的cap氨基酸序列为seqidno.15所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.16所示；泛素特异性肽酶基因的信号肽的氨基酸序列为seqidno.11所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.12所示；催乳素基因的信号肽的氨基酸序列为seqidno.13所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.14所示)。简言之，用表1中列出的引物通过重叠pcr将cap基因插入到npro和c蛋白之间。然后，将pcr产物用标准分子克隆技术分别获得phclv-uspcap和phclv-pspcap，并用多种核酸限制性内切酶和序列测定对获得的重组感染性克隆进行鉴定。表1构建感染性克隆phclv-uspcap和phclv-pspcap所用的引物1.3重组病毒的拯救本发明通过一步法拯救重组病毒rhclv-pspcap和rhclv-uspcap(li,c.,huang,j.,li,y.,he,f.,li,d.,sun,y.,han,w.,li,s.,qiu,h.j.efficientandstablerescueofclassicalswinefevervirusfromclonedcdnausinganrnapolymeraseiisystem.arch.virol.2013,158:901-907.)。具体操作步骤如下：分别将6μgphclv-pspcap或phclv-uspcap转染sk6细胞，然后将细胞盲传10代。将传代后的细胞反复冻融3次，于4℃2,800g离心10min，收取上清病毒液。用csfv抗原捕获elisa检测收获病毒erns蛋白的表达，具体操作步骤参照说明书。1.4间接免疫荧光试验将拯救的两株重组病毒分别接种于生长至70％单层的sk6细胞中，2h后用磷酸盐缓冲溶液(pbs)洗2遍，然后加入新鲜的含2％胎牛血清的dmem，在5％co2、37℃环境中继续培养，48h后弃上清，用4℃预冷的磷酸盐缓冲液(pbs)洗细胞2次，然后用-20℃预冷的无水乙醇固定细胞20min，加入抗csfve2蛋白的单克隆抗体hq06或抗pcv2cap单克隆抗体36a9(1:100稀释)，37℃作用2h后用pbs和含0.05％吐温的pbs分别洗涤3次，加入1:100稀释的fitc标记的羊抗鼠igg，置于湿盒中37℃作用45min，用pbs洗涤3次后，用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)对细胞核进行染色10min，然后用pbs避光洗5遍，置于倒置荧光显微镜下观察。1.5重组病毒的生长曲线测定将两株重组病毒和rhclv分别以感染复数(moi)为0.1的剂量接种于铺有sk6细胞的24孔板中，37℃感染2h后，弃去病毒液，更换新的培养液，再将细胞放在含5％co2的37℃温箱中培养。在接种病毒后不同时间点(12h、24h、36h、48h、60h和72h)收获细胞，反复冻融3次后，于4℃2,800g离心10min，收取上清病毒液。然后用reed-münch方法通过间接免疫荧光试验测定病毒滴度，并用每毫升tcid50表示。实验重复3次，然后计算出平均值和标准偏差(reedandmünch,1938)。1.6家兔接种试验动物实验经过了中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物福利委员会批准，其许可证为syxk(黑龙江)2011022。本发明将36只14周龄新西兰白兔随机分为6组，每组6只。a、b、c和d组分别以耳缘静脉方式接种104tcid50rhclv-pspcap、rhclv-uspcap、rhclv和c株疫苗，e组以皮下注射方式接种1mllg疫苗株，f组以耳缘静脉方式注射1mldmem。接种24h后，每6h记录家兔的直肠温度来监测它们的定型热反应，接种后3d每组随机选取3只安乐处死，采集家兔脾脏，用定量rt-pcr检测家兔脾脏中病毒的rna拷贝数(zhang,x.j.,han,q.y.,sun,y.,zhang,x.,qiu,h.j.developmentofatriplextaqmanreal-timert-pcrassayfordifferentialdetectionofwild-typeandhclvvaccinestrainsofclassicalswinefevervirusandbovineviraldiarrheavirus1.res.vet.sci.2012,92:512-518.)。在接种后3w对剩余所有组家兔加强免疫相同剂量的病毒。整个试验过程中，每隔7d采集所有组家兔的血清，将采集到的家兔血清样本用阻断elisa分别检测抗e2和抗cap蛋白的抗体。1.7阻断elisa免疫前以及免疫后每7d采血，分离血清。用猪瘟抗体检测试剂盒(idexx公司，批号c281)和pcv2cap抗体检测试剂盒(synbiotics公司，批号scirco1n17)检测抗体水平，具体操作方法见说明书。1.8定量rt-pcr采用本实验室建立的荧光定量rt-pcr方法检测家兔脾脏中的病毒rna水平(zhang,x.j.,han,q.y.,sun,y.,zhang,x.,qiu,h.j.developmentofatriplextaqmanreal-timert-pcrassayfordifferentialdetectionofwild-typeandhclvvaccinestrainsofclassicalswinefevervirusandbovineviraldiarrheavirus1.res.vet.sci.2012,92:512-518.)。反应条件95℃5min；95℃30s、60℃45s，40个循环。每个样本的实验进行3个重复。通过标准曲线计算病毒基因组的rna拷贝数。1.9病毒分离试验收集定量rt-pcr检测为阳性的家兔脾脏，研磨后用1mldmem稀释，经0.45μm滤器过滤后接种于铺在六孔细胞培养板中的sk6细胞，按每毫升加入1000iu青霉素，感染2h后弃去病毒液，加入2％胎牛血清的dmem维持细胞生长，5％co237℃细胞培养箱中培养48h。然后用胰酶消化传至细胞瓶中，连续传三代后，反复冻融3次收获细胞。将传代后的细胞反复冻融3次，于4℃2,800g离心10min，收取病毒液保存于-80℃。1.10中和试验用中和试验检测各时间点家兔血清中的中和抗体。具体步骤如下，将血清经56℃灭活30min后，用dmem进行2倍系列稀释，取100μl稀释好的血清，加入等体积200tcid50的csfv石门株或pcv2tj-2013株，在37℃条件下孵育1h。然后将混合液接种于96孔细胞培养板中的单层pk-15细胞中，37℃下孵育2h后，弃去病毒与血清的混合液，换成含有3％fbs的dmem培养液中维持生长，在细胞培养箱中培养48h后进行ifa试验，统计记录结果后计算中和抗体效价。1.11统计学分析应用spss统计学软件对所有数据进行统计学分析，比较各组间的差异。其中，p≥0.05为差异不显著，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。2、实验结果2.1重组病毒的获得将重组感染性克隆phclv-pspcap和phclv-uspcap分别转染sk6细胞拯救重组病毒rhclv-pspcap和rhclv-uspcap，用idexx猪瘟病毒抗原检测elisa检测收取的病毒液中的erns蛋白，结果显示，所拯救的第8代到第10代重组病毒的erns蛋白抗原为阳性(图2)。按照病毒rna提取说明书提取病毒基因组rna后，通过rt-pcr扩增并测序目的基因。结果表明，本发明已成功在重组病毒基因组中引入cap基因；测序结果显示，插入的cap基因不存在任何突变。以上结果证实，本发明成功获得了重组病毒rhclv-pspcap和rhclv-uspcap。本发明将表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株rhclv-uspcap提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：cgmccno.14321。本发明将表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株rhclv-pspcap，提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：cgmccno.14322。2.2外源蛋白在重组病毒中的表达为了鉴定获得的重组病毒中cap蛋白的表达，将rhclv-pspcap和rhclv-uspcap分别感染sk6细胞48h后，通过间接免疫荧光检测cap蛋白的表达。结果显示，用鼠源抗cap单抗检测到感染重组病毒的细胞质中产生特异性荧光(图3)。结果证实，两株重组病毒均能表达去除nls的cap蛋白。2.3重组病毒的生长动力学和遗传稳定性为了评估重组病毒在体外的生长能力，将重组病毒rhclv-uspcap、rhclv-pspcap和亲本病毒rhclv分别接种sk6细胞，通过间接免疫荧光测定不同时间点收取的病毒，并绘制生长曲线(图4)。结果显示，两株重组病毒和亲本病毒具有相似的生长特性，表明外源cap基因的表达并不影响重组病毒的生长能力。为了评价重组病毒在传代过程中的遗传稳定性，本发明将拯救成功的rhclv-uspcap和rhclv-pspcap分别在sk6细胞上连续传代至20代。将第15代到第20代重组病毒的cap基因通过rt-pcr扩增并测序。结果表明，每代病毒中均可扩增到预期大小一致的目的基因(图5)。另外，测序结果显示，cap基因在各代重组病毒的基因组中均保持完整性和正确性。以上结果证实，重组病毒经细胞传代可保持遗传稳定性。2.4重组病毒在家兔体内的生物学特性为了评价重组病毒引起家兔定型热反应和在家兔脾脏中复制的生物学特性，将rhclv-uspcap、rhclv-pspcap、c株、rhclv和dmem经耳缘静脉分别接种家兔。在接种后36h，接种重组病毒的大部分家兔出现发热症状，持续了18-24h，其余家兔出现轻微的发热症状(表2)。接种dmem的家兔体温一直保持正常，并未出现发热症状。在病毒接种后3d，每组随机选取3只家兔，采集家兔脾脏，荧光定量检测脾脏中病毒基因组的拷贝数(表2)。并能从家兔脾脏中分离到重组病毒。csfv抗原捕获elisa和rt-pcr结果表明，本发明在家兔脾脏中成功分离到重组病毒(图6a)，并且插入的外源基因在重组病毒中保持正确性和完整性(图6b)。以上结果表明，所有重组病毒接种家兔后均能保持与亲本病毒一致的生物学特性。表2重组病毒接种后家兔的定型热反应和脾脏中复制情况2.5重组病毒在家兔体内的免疫原性为了检验重组病毒在家兔体的免疫原性，不同组的家兔接种指定的病毒，在接种后的不同时间点检测血清中的抗csfve2和pcv2cap抗体。结果表明，a、b、c和d组的所有家兔在免疫后10d可以产生高水平的抗e2特异性抗体(表2)及抗csfv的中和抗体(表3)，a、b组部分家兔和e组所有家兔在加强免疫后3w产生抗cap蛋白的抗体(表4)及抗pcv2的中和抗体(表5)。表3接种重组病毒的家兔血清中抗csfv中和抗体滴度表4接种重组病毒后家兔的抗pcv2cap抗体阳转情况表5接种重组病毒的家兔血清中抗pcv2中和抗体滴度综上，本发明利用反向遗传学操作系统，构建了表达pcv2cap蛋白的2株重组c株，建立了c株作为活病毒载体表达外源基因的平台，为研制能够同时抵抗猪瘟和猪圆环病毒病的二价疫苗奠定了基础。sequencelisting<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所<120>表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株及其应用<130>hlj-2001-170613a<160>16<170>patentinversion3.5<210>1<211>27<212>dna<213>artificalsequence<400>1cacctcgagatgctacgtggacgaggg27<210>2<211>79<212>dna<213>artificalsequence<400>2gggctgcagcagaaagtatcactgtagacattaaaatagctgagataatcttttttttca60tcccacttgcgccatcatc79<210>3<211>79<212>dna<213>artificalsequence<400>3ctttctgctgcagccccgttgtcaggtgtttacgccctggaaataagcagcacctgcgat60gcaggcatcttcaacaccc79<210>4<211>26<212>dna<213>artificalsequence<400>4ctgatgcatgcaccttgacagtcgtg26<210>5<211>27<212>dna<213>artificalsequence<400>5cacctcgagatgctacgtggacgaggg27<210>6<211>79<212>dna<213>artificalsequence<400>6gaccaccagcagcagcagcagccgtgatcctttctgggagctccccttactgtccatccc60acttgcgccatcatcggag79<210>7<211>79<212>dna<213>artificalsequence<400>7ggctgctgctgctgctggtggtcagcaacctgctgctgcctcagggggtggtcggaggca60tcttcaacacccgcctctc79<210>8<211>26<212>dna<213>artificalsequence<400>8ctgatgcatgcaccttgacagtcgtg26<210>9<211>7<212>prt<213>artificalsequence<400>9seraspaspglyalasergly15<210>10<211>19<212>prt<213>artificalsequence<400>10alathrasnpheserleuleulysglnalaglyaspvalglugluasn151015proglypro<210>11<211>27<212>prt<213>artificalsequence<400>11metlyslyslysileileseralaileleumetserthrvalileleu151015seralaalaalaproleuserglyvaltyrala2025<210>12<211>81<212>dna<213>artificalsequence<400>12atgaaaaaaaagattatctcagctattttaatgtctacagtgatactttctgctgcagcc60ccgttgtcaggtgtttacgcc81<210>13<211>30<212>prt<213>artificalsequence<400>13metaspserlysglyserserglnlysglyserargleuleuleuleu151015leuvalvalserasnleuleuleuproglnglyvalvalgly202530<210>14<211>90<212>dna<213>artificalsequence<400>14atggacagtaaggggagctcccagaaaggatcacggctgctgctgctgctggtggtcagc60aacctgctgctgcctcagggggtggtcgga90<210>15<211>191<212>prt<213>artificalsequence<400>15glyilepheasnthrargleuserargthrpheglytyrthrilelys151015argthrthrvalargthrprosertrpalavalaspmetmetargphe202530asnileasnasppheleuproproglyglyglyserasnproargser354045valpropheglutyrtyrargilearglysvallysvalgluphetrp505560procysserproilethrglnglyaspargglyvalglyserserala65707580valileleuaspaspasnphevalthrlysalathralaleuthrtyr859095aspprotyrvalasntyrserserarghisthrilethrglnprophe100105110sertyrhisserargtyrphethrprolysprovalleuaspserthr115120125ileasptyrpheglnproasnasnlysargasnglnleutrpleuarg130135140leuglnthralaglyasnvalasphisvalglyleuglythralaphe145150155160gluasnseriletyraspglnglutyrasnileargvalthrmettyr165170175valglnpheargglupheasnleulysaspproproleuasnpro180185190<210>16<211>573<212>dna<213>artificalsequence<400>16ggcatcttcaacacccgcctctcccgcaccttcggatatactatcaagcgaaccacagtc60agaacgccctcctgggcggtggacatgatgagattcaatattaatgactttcttccccca120ggagggggctcaaacccccgctctgtgccctttgaatactacagaataagaaaggttaag180gttgaattctggccctgctccccgatcacccagggtgacaggggagtgggctccagtgct240gttattctggatgataactttgtaacaaaggccacagccctcacctatgacccctatgta300aactactcctcccgccataccataacccagcccttctcctaccactcccgctactttacc360cccaaacctgtcctagattccactattgattacttccaaccaaacaacaaaagaaaccag420ctgtggctgagactacaaactgctggaaatgtagaccacgtaggcctcggcactgcgttc480gaaaacagtatatacgaccaggaatacaatatccgtgtaaccatgtatgtacaattcaga540gaatttaatcttaaagaccccccacttaaccct573当前第1页12当前第1页12