检测PML基因突变的方法、引物和试剂盒与流程

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测与急性早幼粒白血病(apl)发生有关的pml基因突变的引物、方法和试剂盒。

背景技术：

急性早幼粒白血病(acutepromyelocyticleukemia,apl)是一种起病凶险的恶性血液病，单纯依赖化疗，患者复发率高，总体生存较差。apl在中国人群中的发病率较其他人群高，可高达aml的17％～25.3％。apl的分子遗传学标志是pml-rara融合基因的形成，产生的pml-rara融合蛋白不仅是apl的分子标志，而且在apl发病中起关键作用。pml-rara融合蛋白可以与维甲酸受体(rxr)结合，中断正常的维甲酸信号通路，抑制基因转录，阻滞粒细胞分化，最终导致apl的发生。近来研究表明pml-rara的降解在apl白血病干细胞(leukemia-initiatingcell,lic)的清除中起着重要的作用。

pml基因位于15号染色体，包含10个外显子，属于trim家族。pml选择性剪接产生了不同分子量的亚型：pmli是最长的亚型，由882个氨基酸组成，最短的亚型是pmlviib，仅有435个氨基酸构成。rbcc/trim结构域存在于所有的pml亚型中，由外显子1～3编码。rbcc结构域有一个末端环指结构域(r)、两个b-box结构域(b1和b2)和一个α螺旋卷曲螺旋结构域组成。pml蛋白具有多种生物学活性，包括抗病毒活性、肿瘤抑制作用、参与祖细胞分化、调节基因转录、诱导细胞凋亡等等。有研究表明pml的降解对于慢性粒细胞白血病(cml)静止期lic的清除有重要作用。pml的类泛素化促进前髓细胞白血病核小体(pml-nbs)形成，从而促进pml依赖的肿瘤抑制效应。

三氧化二砷(as203)治疗可以使apl患者达到完全缓解，能够选择性地作用于pml-rara和pml，导致蛋白降解。as203能够促进pml的核基质转移、sumo化修饰和降解，在6h左右能够促进pml-nbs的增大；对于apl细胞，as203在12h左右能够促使pml-nbs重新形成，24h左右能够促使pml-rara的降解。有研究显示as203对pml-rara有类似的生物学效应，而对rara则没有作用，这也说明pml-rara融合蛋白中的pml部分是as203的直接作用靶点。

2014年最新版美国权威指南nccn(nationalcomprehensivecancernetwork)和我国急性早幼粒细胞白血病诊治指南均新增维甲酸+砷剂作为apl患者的一线选择推荐。黄晓军课题组在一项研究中首次发现4个新的pml突变位点——a216t/s214l/l217f/s220g，并提出砷剂耐药时pml突变存在一个“突变热点区(c202-s220)”，该热点突变区位于pml基因的外显子3，即rbcc结构域中的b2结构域。文献报道指出，a216v、s214l、a216t对砷剂治疗具有强耐受，l217f、s220g对砷剂治疗表现弱耐受。这些发现完善了人们对apl患者砷剂耐药机制的认识。

因此，对pml基因多态性的检测，将有助于apl患者在砷剂治疗过程中进行耐药监测，从而及时调整治疗方案，提高治愈率，减少复发，在临床上具有重要的意义，有望实现apl的分层治疗和个性化治疗，并为下一步克服耐药的研究提供靶点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供检测pml基因突变的引物，所述引物包括：至少一对扩增引物用于扩增pml基因，所述至少一对扩增引物选自

pml-exon1-f/pml-exon1-r、pml-exon2-f/pml-exon2-r、

pml-exon3-f/pml-exon3-r、pml-exon4-f/pml-exon4-r、

pml-exon5/6-f/pml-exon5/6-r、pml-exon7-f/pml-exon7-r、

pml-exon8-f/pml-exon8-r、pml-exon9-f/pml-exon9-r、

pml-exon10-f/pml-exon10-r，其碱基序列为：

pml-exon1-f：tgtaaaacgacggccagtccgctttaccgtaagtcag

pml-exon1-r：aacagctatgaccatgcaaatcctccgttagaccc

pml-exon2-f：tgtaaaacgacggccagtgggcttttgggacttctc

pml-exon2-r：aacagctatgaccatgcctctacctggtacttgga

pml-exon3-f：tgtaaaacgacggccagtcaggatagtgcctttggc

pml-exon3-r：aacagctatgaccatgctgtgccctggaacctaa

pml-exon4-f：tgtaaaacgacggccagtgcactctaatgccacctc

pml-exon4-r：aacagctatgaccatggacctcaaacccatctcag

pml-exon5/6-f：tgtaaaacgacggccagtaaaggaggtgatgtgatgg

pml-exon5/6-r：aacagctatgaccatgggtgagactgccttggag

pml-exon7-f：tgtaaaacgacggccagtatagataaggcacagcaaga

pml-exon7-r：aacagctatgaccatgccctgggacctgaaatgg

pml-exon8-f：tgtaaaacgacggccagtaatccctgacgcttggtt

pml-exon8-r：aacagctatgaccatgggctctgcctgcacttct

pml-exon9-f：tgtaaaacgacggccagtctgctatcccaccacaacc

pml-exon9-r：aacagctatgaccatgcggccttggagtagatgc

pml-exon10-f：tgtaaaacgacggccagtgccctctttggcacatta

pml-exon10-r：aacagctatgaccatgagaaggagaccctggagc。

进一步地，还包括一对测序引物m13f和m13r，其碱基序列为：

m13f：tgtaaaacgacggccagt

m13r：aacagctatgaccatg。

本发明的目的还在于提供一种检测pml基因突变的方法，包括以下步骤：

(1)提取样本中的dna；

(2)利用至少一对扩增引物对(1)中的dna进行扩增，获得扩增产物；

(3)利用一对测序引物对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的碱基序列；

(4)将(3)中的碱基序列与pml基因外显子野生型参考序列进行比较，确定突变位点是否存在，所述至少一对扩增引物选自pml-exon1-f/pml-exon1-r、

pml-exon2-f/pml-exon2-r、pml-exon3-f/pml-exon3-r、

pml-exon4-f/pml-exon4-r、pml-exon5/6-f/pml-exon5/6-r、

pml-exon7-f/pml-exon7-r、pml-exon8-f/pml-exon8-r、

pml-exon9-f/pml-exon9-r、pml-exon10-f/pml-exon10-r；所述一对测序引物选自m13f和m13r，其碱基序列为：

pml-exon1-f：tgtaaaacgacggccagtccgctttaccgtaagtcag

pml-exon1-r：aacagctatgaccatgcaaatcctccgttagaccc

pml-exon2-f：tgtaaaacgacggccagtgggcttttgggacttctc

pml-exon2-r：aacagctatgaccatgcctctacctggtacttgga

pml-exon3-f：tgtaaaacgacggccagtcaggatagtgcctttggc

pml-exon3-r：aacagctatgaccatgctgtgccctggaacctaa

pml-exon4-f：tgtaaaacgacggccagtgcactctaatgccacctc

pml-exon4-r：aacagctatgaccatggacctcaaacccatctcag

pml-exon5/6-f：tgtaaaacgacggccagtaaaggaggtgatgtgatgg

pml-exon5/6-r：aacagctatgaccatgggtgagactgccttggag

pml-exon7-f：tgtaaaacgacggccagtatagataaggcacagcaaga

pml-exon7-r：aacagctatgaccatgccctgggacctgaaatgg

pml-exon8-f：tgtaaaacgacggccagtaatccctgacgcttggtt

pml-exon8-r：aacagctatgaccatgggctctgcctgcacttct

pml-exon9-f：tgtaaaacgacggccagtctgctatcccaccacaacc

pml-exon9-r：aacagctatgaccatgcggccttggagtagatgc

pml-exon10-f：tgtaaaacgacggccagtgccctctttggcacatta

pml-exon10-r：aacagctatgaccatgagaaggagaccctggagc；

m13f：tgtaaaacgacggccagt

m13r：aacagctatgaccatg。

本发明的目的还在于一种检测pml基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系pcr扩增反应液、测序体系试剂，其中，检测体系pcr扩增反应液包括至少一对扩增引物，所述测序体系试剂包括一对测序引物，所述至少一对扩增引物选自pml-exon1-f/pml-exon1-r、pml-exon2-f/pml-exon2-r、

pml-exon3-f/pml-exon3-r、pml-exon4-f/pml-exon4-r、

pml-exon5/6-f/pml-exon5/6-r、pml-exon7-f/pml-exon7-r、

pml-exon8-f/pml-exon8-r、pml-exon9-f/pml-exon9-r、

pml-exon10-f/pml-exon10-r；所述一对测序引物选自m13f和m13r，其碱基序列为：

pml-exon1-f：tgtaaaacgacggccagtccgctttaccgtaagtcag

pml-exon1-r：aacagctatgaccatgcaaatcctccgttagaccc

pml-exon2-f：tgtaaaacgacggccagtgggcttttgggacttctc

pml-exon2-r：aacagctatgaccatgcctctacctggtacttgga

pml-exon3-f：tgtaaaacgacggccagtcaggatagtgcctttggc

pml-exon3-r：aacagctatgaccatgctgtgccctggaacctaa

pml-exon4-f：tgtaaaacgacggccagtgcactctaatgccacctc

pml-exon4-r：aacagctatgaccatggacctcaaacccatctcag

pml-exon5/6-f：tgtaaaacgacggccagtaaaggaggtgatgtgatgg

pml-exon5/6-r：aacagctatgaccatgggtgagactgccttggag

pml-exon7-f：tgtaaaacgacggccagtatagataaggcacagcaaga

pml-exon7-r：aacagctatgaccatgccctgggacctgaaatgg

pml-exon8-f：tgtaaaacgacggccagtaatccctgacgcttggtt

pml-exon8-r：aacagctatgaccatgggctctgcctgcacttct

pml-exon9-f：tgtaaaacgacggccagtctgctatcccaccacaacc

pml-exon9-r：aacagctatgaccatgcggccttggagtagatgc

pml-exon10-f：tgtaaaacgacggccagtgccctctttggcacatta

pml-exon10-r：aacagctatgaccatgagaaggagaccctggagc；

m13f：tgtaaaacgacggccagt

m13r：aacagctatgaccatg。

进一步地，所述检测体系pcr扩增反应液还包括2×pcrbuffer、dntps和kodfxdnapolymerase。

进一步地，所述测序体系试剂还包括测序纯化液、edta、无水乙醇、75％乙醇、hidi和bigdyeterminatorv3.1。

进一步地，所述测序纯化液包括核酸外切酶i和牛小肠碱性磷酸酶。

进一步地，所述试剂盒还包括空白对照品。

本发明的有益效果：(1)本发明设计了扩增pml基因全部10个外显子序列的引物，并且通过加接头，使所有9对引物的pcr产物均可以用一种测序引物进行测序；(2)采用pcr技术，构建了稳定的扩增体系，通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，此外，pml基因的突变类型种类繁多且遍布整个基因，因此本发明所述引物既能将所述pml全外显子序列都扩增出来，也保证无论这些外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况；(3)相比较荧光定量pcr法降低了检测的成本和难度，这是因为荧光定量pcr法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大；(4)基于pml不同外显子的序列特征，本发明让pml基因的外显子5和外显子6共用一对扩增引物，即利用一对扩增引物pml-exon5/6-f和pml-exon5/6-r将pml基因的外显子5和外显子一起扩增，而不用分别针对外显子5和外显子6设计一对扩增引物，这不仅能够降低设计的扩增引物数量，而且还能有效地节省检测试剂用量和检测成本。

附图说明

图1为pml基因在人染色体上定位图。

图2～10为9对引物扩增pml基因10个外显子的pcr产物电泳图，m为markerdl2000，1～16为送检的血液样本1～16号。

图11～19分别为样本1的pml基因第1～10号外显子野生型测序截图。

图11显示是样本1的pml基因1号外显子野生型测序截图。

图12显示是样本1的pml基因2号外显子野生型测序截图。

图13显示是样本1的pml基因3号外显子野生型测序截图。

图14显示是样本1的pml基因4号外显子野生型测序截图。

图15显示是样本1的pml基因5、6号外显子野生型测序截图。

图16显示是样本1的pml基因7号外显子野生型测序截图。

图17显示是样本1的pml基因8号外显子野生型测序截图。

图18显示是样本1的pml基因9号外显子野生型测序截图。

图19显示是样本1的pml基因10号外显子野生型测序截图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

一种检测pml基因突变的引物，所述引物是针对pml全部外显子设计的，包括：

(1)扩增pml基因第1外显子序列的引物：

pml-exon1-f：tgtaaaacgacggccagtccgctttaccgtaagtcag

pml-exon1-r：aacagctatgaccatgcaaatcctccgttagaccc；

(2)扩增pml基因第2外显子序列的引物：

pml-exon2-f：tgtaaaacgacggccagtgggcttttgggacttctc

pml-exon2-r：aacagctatgaccatgcctctacctggtacttgga；

(3)扩增pml基因第3外显子序列的引物：

pml-exon3-f：tgtaaaacgacggccagtcaggatagtgcctttggc

pml-exon3-r：aacagctatgaccatgctgtgccctggaacctaa；

(4)扩增pml基因第4外显子序列的引物：

pml-exon4-f：tgtaaaacgacggccagtgcactctaatgccacctc

pml-exon4-r：aacagctatgaccatggacctcaaacccatctcag；

(5)扩增pml基因第5/6外显子序列的引物：

pml-exon5/6-f：tgtaaaacgacggccagtaaaggaggtgatgtgatgg

pml-exon5/6-r：aacagctatgaccatgggtgagactgccttggag；

(6)扩增pml基因第7外显子序列的引物：

pml-exon7-f：tgtaaaacgacggccagtatagataaggcacagcaaga

pml-exon7-r：aacagctatgaccatgccctgggacctgaaatgg；

(7)扩增pml基因第8外显子序列的引物：

pml-exon8-f：tgtaaaacgacggccagtaatccctgacgcttggtt

pml-exon8-r：aacagctatgaccatgggctctgcctgcacttct。

(8)扩增pml基因第9外显子序列的引物：

pml-exon9-f：tgtaaaacgacggccagtctgctatcccaccacaacc

pml-exon9-r：aacagctatgaccatgcggccttggagtagatgc；

(9)扩增pml基因第10外显子序列的引物：

pml-exon10-f：tgtaaaacgacggccagtgccctctttggcacatta

pml-exon10-r：aacagctatgaccatgagaaggagaccctggagc；

特别地，所述引物还包括一对测序引物m13f和m13r，所述测序碱基序列为：

m13f：tgtaaaacgacggccagt

m13r：aacagctatgaccatg。

一种检测pml基因突变的试剂盒，包括

(1)检测体系pcr反应液；

(2)测序体系试剂；

检测体系pcr扩增反应液包括：2×pcrbuffer；2mmdntps；kodfxdnapolymerase(1u/μl)；扩增pml基因的至少一对扩增引物，所述至少一对扩增引物选自pml-exon1-f(10μm)/pml-exon1-r(10μm)、pml-exon2-f(10μm)/pml-exon2-r(10μm)、pml-exon3-f(10μm)/pml-exon3-r(10μm)、pml-exon4-f(10μm)/pml-exon4-r(10μm)、pml-exon5/6-f(10μm)/pml-exon5/6-r(10μm)、pml-exon7-f(10μm)/pml-exon7-r(10μm)、pml-exon8-f(10μm)/pml-exon8-r(10μm)、pml-exon9-f(10μm)/pml-exon9-r(10μm)、pml-exon10-f(10μm)/pml-exon10-r(10μm)，其中，这些扩增引物的序列为：

pml-exon1-f：tgtaaaacgacggccagtccgctttaccgtaagtcag

pml-exon1-r：aacagctatgaccatgcaaatcctccgttagaccc

pml-exon2-f：tgtaaaacgacggccagtgggcttttgggacttctc

pml-exon2-r：aacagctatgaccatgcctctacctggtacttgga

pml-exon3-f：tgtaaaacgacggccagtcaggatagtgcctttggc

pml-exon3-r：aacagctatgaccatgctgtgccctggaacctaa

pml-exon4-f：tgtaaaacgacggccagtgcactctaatgccacctc

pml-exon4-r：aacagctatgaccatggacctcaaacccatctcag

pml-exon5/6-f：tgtaaaacgacggccagtaaaggaggtgatgtgatgg

pml-exon5/6-r：aacagctatgaccatgggtgagactgccttggag

pml-exon7-f：tgtaaaacgacggccagtatagataaggcacagcaaga

pml-exon7-r：aacagctatgaccatgccctgggacctgaaatgg

pml-exon8-f：tgtaaaacgacggccagtaatccctgacgcttggtt

pml-exon8-r：aacagctatgaccatgggctctgcctgcacttct

pml-exon9-f：tgtaaaacgacggccagtctgctatcccaccacaacc

pml-exon9-r：aacagctatgaccatgcggccttggagtagatgc

pml-exon10-f：tgtaaaacgacggccagtgccctctttggcacatta

pml-exon10-r：aacagctatgaccatgagaaggagaccctggagc。

测序体系试剂包括：测序纯化液，包括0.6u核酸外切酶i(exoi)和1.2u小牛肠碱性磷酸酶(cip)；edta(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、hidi(高度去离子甲酰胺)：一对测序引物m13f(3.2μm)和m13r(3.2μm),以及bigdyeterminatorv3.1(购买自美国appliedbiosystems公司)，其中，这对测序引物的序列为：

m13f：tgtaaaacgacggccagt

m13r：aacagctatgaccatg。

优选地，该试剂盒还包括血液dna抽提试剂。所述血液dna抽提试剂，可自行配制，也可从市场上购买，如购买天根生物科技有限公司购买的血液dna抽提试剂。

优选地，该试剂盒还包括空白对照品。空白对照品为2μl生理盐水或不加任何物质。

实施例2

血液/细胞/组织基因组dna抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液样本中的组织dna：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液ga，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱cb3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中，获得样本dna溶液。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份19μl分装：

x＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照品)

n为检测标本数。

(3)加样：将(1)中获得的样本dna溶液以及空白对照品各取1μl分别加入反应管中。

(4)扩增：检测在常规pcr仪上进行，可用仪器包括abiveriti(美国appliedbiosystems公司)等。pcr扩增反应条件如表1所示。测体系pcr扩增反应液配制方法如表2所示。用于pcr扩增的每对引物的相关性质如表3所示。

表1.pcr扩增反应条件

表2.检测体系pcr扩增反应液配制

注：表中的primerf/primerr选自pml-exon1-f/pml-exon1-r、

pml-exon2-f/pml-exon2-r、pml-exon3-f/pml-exon3-r、pml-exon4-f/pml-exon4-r、pml-exon5/6-f/pml-exon5/6-r、pml-exon7-f/pml-exon7-r、pml-exon8-f/pml-exon8-r、pml-exon9-f/pml-exon9-r、pml-exon10-f/pml-exon10-r。pcr所用kodfox由toyobo公司提供，引物primerf和primerr由上海英潍捷基公司合成。

表3.pcr扩增时每对扩增引物的相关性质

(5)电泳：对(4)中的扩增产物进行电泳，电泳条件为1.5％琼脂糖凝胶电泳，110v，25min。电泳结束后，进行凝胶成像系统观察。

如图2～10所示，即取16例血液样本以pml-exon1-f/pml-exon1-r、

pml-exon2-f/pml-exon2-r、pml-exon3-f/pml-exon3-r、

pml-exon4-f/pml-exon4-r、pml-exon5/6-f/pml-exon5/6-r、

pml-exon7-f/pml-exon7-r、pml-exon8-f/pml-exon8-r、

pml-exon9-f/pml-exon9-r、pml-exon10-f/pml-exon10-r引物扩增后所得产物的电泳图谱。本发明扩增的片段长度分别为490bp、572bp、589bp、320bp、927bp、338bp、258bp、275bp、474bp，通过电泳图的分析表明本发明所述

pml-exon1-f/pml-exon1-r、pml-exon2-f/pml-exon2-r、

pml-exon3-f/pml-exon3-r、pml-exon4-f/pml-exon4-r、

pml-exon5/6-f/pml-exon5/6-r、pml-exon7-f/pml-exon7-r、

pml-exon8-f/pml-exon8-r、pml-exon9-f/pml-exon9-r、

pml-exon10-f/pml-exon10-r扩增有效，且条带单一。

(6)sanger测序：

取9μlpcr产物与2μl纯化体系。按照表4所示的程序进行纯化：

表4

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照表5的体系进行混合：

表5

测序反应程序如表6所示：

表6

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的edta，静置5min；加入15l无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50l70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μlhi-di后进行变性试验。变性程序：

变性程序结束后，上测序仪(abi3730)测序。

(7)结果判断：分别将测序结果与pml野生型参考序列(genbank：nc_000015.10)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取16例的临床样本(样本编号为1～16)按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份样本加入检测体系pcr反应液中1μl。电泳结果如图2～10所示，表明本发明所述引物pml-exon1-f/pml-exon1-r、

pml-exon2-f/pml-exon2-r、pml-exon3-f/pml-exon3-r、

pml-exon4-f/pml-exon4-r、pml-exon5/6-f/pml-exon5/6-r、

pml-exon7-f/pml-exon7-r、pml-exon8-f/pml-exon8-r、

pml-exon9-f/pml-exon9-r、pml-exon10-f/pml-exon10-r对这16例血液样本能有效扩增，且条带单一。

样本1的部分检测结果如图11、12、13、14、15、16、17、18、19所示。从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩增出pml基因全部10个外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确地扩增出pml基因全外显子，无论是野生型还是突变型。

序列表

<110>南昌艾迪康医学检验实验室有限公司

<120>检测pml基因突变的方法、引物和试剂盒

<160>20

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>37

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgtaaaacgacggccagtccgctttaccgtaagtcag37

<210>2

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aacagctatgaccatgcaaatcctccgttagaccc35

<210>3

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tgtaaaacgacggccagtgggcttttgggacttctc36

<210>4

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aacagctatgaccatgcctctacctggtacttgga35

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tgtaaaacgacggccagtcaggatagtgcctttggc36

<210>6

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

aacagctatgaccatgctgtgccctggaacctaa34

<210>7

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

tgtaaaacgacggccagtgcactctaatgccacctc36

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

aacagctatgaccatggacctcaaacccatctcag35

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

tgtaaaacgacggccagtaaaggaggtgatgtgatgg37

<210>10

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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aacagctatgaccatgggtgagactgccttggag34

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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tgtaaaacgacggccagtatagataaggcacagcaaga38

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<212>dna

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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