提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP及其制备和使用方法与流程

本发明属于生物基因工程领域，特别是涉及一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pcdsp，还涉及一种该质粒pcdsp的制备方法，还涉及一种该质粒pcdsp的使用方法。

背景技术

角鲨烯是一种天然存在于多种微生物及动植物细胞内的三萜烯类化合物，具有抗氧化，保护心脏，提高免疫力，降低血脂及抑制癌症发展等多种功效，已被广泛应用于医药及保健品领域。当前，市面上的角鲨烯主要来源于植物种子及动物肝脏的提取，因此价格比较昂贵，另外通过提取的方法获得还具有周期长、成本高、破坏环境等缺点，因此，亟需新的更环保、更廉价的生产方式。

微生物发酵生产活性化合物具有廉价、快速、环保等优点。近年来，诸多研究致力于利用酵母、微藻及沼泽红假单胞菌等微生物进行角鲨烯的发酵生产，但均未实现突破，其产量与工业化生产要求尚有较大差距。究其原因，角鲨烯含量低或发酵密度低等因素限制了角鲨烯的最终产量。

技术实现要素：

本发明的第一目的是提供一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pcdsp，用于提高大肠杆菌中角鲨烯的合成。

本发明的第二个目的是提供一种上述质粒pcdsp的制备方法，用于制备该质粒pcdsp。

本发明的第三个目的是提供一种利用质粒pcdsp提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，用以实现如何使用该质粒pcdsp促使大肠杆菌大量合成角鲨烯。

为了达到上述第一个目的，本发明所采用的第一种技术方案是，一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pcdsp，包括载体pcdfduet-1，载体pcdfduet-1内插入有阻碍蛋白表达基因laci、大肠杆菌复制起始位点cdfori、链霉素抗性基因和scp-2蛋白基因scp2，scp-2蛋白基因scp2上游具有pt7启动子以启动scp-2蛋白基因scp2的表达，质粒pcdsp的核苷酸序列如序列1所示，scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示。

为了达到上述第二个目的，本发明所采用的第二个技术方案是，一种质粒pcdsp的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，依据大鼠scp-2蛋白的氨基酸序列，并根据大肠杆菌密码子偏好性设计出适合大肠杆菌表达的scp-2蛋白基因scp2，之后将scp-2蛋白基因scp2插入载体puc57中得到质粒pucsp，scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示；

步骤2，质粒pucsp中的scp-2蛋白基因scp2通过酶切和连接反应插入载体pcdfduet-1中，形成质粒pcdsp；

步骤3，利用菌落pcr与双酶切方法对质粒pcdsp进行验证。

本发明的第二种技术方案，还具有以下特点：

在所述步骤1中，scp-2蛋白基因scp2的两端分别添加有ncoi(ccatgg)酶切位点和ecori(gaattc)酶切位点。

在所述步骤2中，先采用ncoi与ecori两种限制性内切酶对质粒pucsp与载体pcdfduet-1分别进行双酶切，然后通过凝胶电泳回收scp-2蛋白基因scp2片段与线性化的载体pcdfduet-1，之后再通过连接反应将scp-2蛋白基因片段插入线性化的载体pcdfduet-1并转入大肠杆菌dh5α中，最后利用氨苄青霉素抗性筛选得到质粒pcdsp。

为了达到上述第三个目的，本发明所采用的技术方案是，一种利用质粒pcdsp提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先将野生菌株e.colic43(de3)制备成氯化钙感受态细胞，然后通过热击法转化质粒ptsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落pcr验证获得能够合成角鲨烯的重组菌e.colicsq1，质粒ptsqs的核苷酸序列如序列4所示；

步骤2，热击法转化质粒pcdsp，利用链霉素抗性筛选和菌落pcr验证获得重组菌e.colicssp1；

步骤3，分析重组菌e.colicssp1中角鲨烯的含量。

本发明的第三种技术方案，还具有以下特点：

所述步骤3具体为：先将采用lb液体培养基培养e.colicssp1，并加入诱导剂iptg诱导scp-2蛋白基因scp2表达；之后通过皂化法分离、提取合成的角鲨烯；最后通过高效液相色谱法检测该角鲨烯的含量。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提供的用于提高大肠杆菌中角鲨烯的含量的方法，通过表达scp-2蛋白促使角鲨烯从内膜上萃取以增加角鲨烯的储存空间，最终提高了角鲨烯的积累量；

(2)本发明提供的质粒pcdsp用于表达scp-2蛋白以萃取角鲨烯，含有链霉素抗性基因作为筛选标记，以强启动子pt7通过控制scp-2蛋白基因scp2的表达来提高scp-2蛋白的表达量；

(3)本发明提供的质粒pcdsp为大肠杆菌发酵生产角鲨烯提供了有效的方法与工具。

附图说明

图1是本发明所涉及的质粒pcdsp的构建原理图；

图2是本发明所涉及的质粒pcdsp中scp-2蛋白基因scp2双酶切回收凝胶电泳图；

图3是本发明所涉及的质粒pcdsp及其验证示意图；

图4是本发明所涉及的质粒pcdsp的菌落pcr验证图；

图5是本发明所涉及的质粒pcdsp的双酶切验证凝胶电泳图；

图6是本发明所涉及的标准品、重组菌e.colicsq1以及重组菌e.colicssp1合成的角鲨烯的验证高效液相色谱图。

具体实施方式

以下结合附图说明和具体实施例对本发明的技术方案作进一步地详细说明。

实施例1

一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pcdsp，包括载体pcdfduet-1，载体pcdfduet-1内插入有阻碍蛋白表达基因laci、大肠杆菌复制起始位点cdfori、链霉素抗性基因和scp-2蛋白基因scp2，scp-2蛋白基因scp2上游具有pt7启动子以启动scp-2蛋白基因scp2的表达，质粒pcdsp的核苷酸序列如序列1所示，scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示。

实施例2

一种上述质粒pcdsp的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，依据大鼠scp-2蛋白的氨基酸序列，并根据大肠杆菌密码子偏好性设计出适合大肠杆菌表达的scp-2蛋白基因scp2，之后将scp-2蛋白基因scp2插入载体puc57中得到质粒pucsp，scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示；

步骤2，质粒pucsp中的scp-2蛋白基因scp2通过酶切和连接反应插入载体pcdfduet-1中，形成质粒pcdsp，具体为：

先采用ncoi与ecori两种限制性内切酶对质粒pucsp与载体pcdfduet-1分别进行双酶切，然后通过凝胶电泳回收从质粒pucsp中切下的scp-2蛋白基因scp2片段与线性化的载体pcdfduet-1，之后再通过连接反应将scp-2蛋白基因插入线性化的载体pcdfduet-1并转入大肠杆菌dh5α中，利用氨苄青霉素抗性筛选得到质粒pcdsp；

步骤3，利用菌落pcr与双酶切方法对质粒pcdsp进行验证。

实施例3

一种利用上述质粒pcdsp提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先将野生菌株e.colic43(de3)制备成氯化钙感受态细胞，然后通过热击法转化质粒ptsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落pcr验证获得重组菌e.colicsq1，质粒ptsqs的核苷酸序列如序列3所示；

步骤2，热击法转化质粒pcdsp，利用链霉素抗性筛选和菌落pcr验证获得重组菌e.colicssp1；

步骤3，分析重组菌e.colicssp1中角鲨烯的含量，具体为：

先采用lb液体培养基培养e.colicssp1，之后加入诱导剂iptg诱导scp-2蛋白基因scp2表达；之后通过皂化法分离、提取合成的角鲨烯；最后通过高效液相色谱法检测该角鲨烯的含量。

其中，e.colicsq1为在野生型e.colic43(de3)基础上转入质粒ptsqs构建而来，野生菌株e.colic43(de3)的dna序列为genbank号，具体为cp011938.1的序列(bct17-dec-2015)；e.colicsq1菌株在西安医学院分子病毒与病毒免疫学实验室保藏，载体ptrc99a购自nonagon公司。载体pcdfduet-1购自nonagon公司，质粒pucsp(puc57质粒中插入合成的scp-2基因)由华大基因科技有限公司提供；限制性内切酶(ncoi与ecori)、t4连接酶、extaq聚合酶、dh5α感受态细胞以及250bpdnamarker等均购自takara公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生物科技有限公司；无水na2so4、色谱级甲醇、己烷及二氯甲烷等化学试剂均购自海默生物科技有限公司；角鲨烯标准品购自sigma公司。质粒ptsqs包括载体ptrc99a，载体ptrc99a内插入有阻碍蛋白表达基因laciq、复制起始位点pbr_322ori、氨苄青霉素抗性基因和角鲨烯合酶基因erg9，角鲨烯合酶基因erg9的上游有启动子ptrc，角鲨烯合酶基因erg9的基因下游包含1个多克隆位点(multiplecloningsite,mcs)，质粒ptsqs的核苷酸序列如序列3所示，角鲨烯合酶基因erg9的核苷酸序列如序列4所示。

scp-2蛋白基因scp2的设计与合成：

(1)在美国国立生物技术信息中心(ncbi)网站查找到genbank号为aah81713.1(rod15-jul-2006)大鼠的scp-2蛋白的氨基酸序列(序列2)；

(2)依据大肠杆菌密码子偏好性设计出适合大肠杆菌中表达的scp-2蛋白基因scp2，scp-2蛋白基因scp2的氨基酸序列如序列3所示，在scp-2蛋白基因scp2的序列两端分别加上ncoi(ccatgg)与ecori(gaattc)酶切位点后，将该序列送往华大基因合成并将其插入载体puc57形成质粒pucsp。

质粒pcdsp的制备：构建过程如图1所示，首先，采用ncoi与ecori两种限制性内切酶对质粒pucsp进行双酶切，通过凝胶电泳回收scp-2蛋白基因scp2片段；然后同样对载体pcdfduet-1进行双酶切并进行回收，进一步通过连接反应将scp-2蛋白基因scp2插入载体pcdfduet-1并转入大肠杆菌dh5α中；最后利用氨苄青霉素抗性筛选，再经过菌落pcr与双酶切验证得到质粒pcdsp。

具体来说：

步骤1，获取带粘性末端的scp-2蛋白基因scp2：

(1)采用ncoi与ecori两种限制性内切酶对质粒pucsp进行酶切反应；

酶切反应体系为：10×qcbuffer，10μl；ncoi，2μl；ecori，2μl；pucsp，30μl；ddh2o，56μl；总体积为100μl。

酶切反应条件为：37℃水浴锅放置6h；

实验结果为：酶切反应液进行凝胶电泳后分别获得一条1653bp(scp-2蛋白基因scp2)和一条2704bp(载体puc57)的条带，结果如图2所示。

(2)依照凝胶回收试剂盒操作说明对scp-2蛋白基因scp2进行回收；

(3)通过酶标仪对回收的scp-2蛋白基因scp2进行浓度测定，并将其放入-20℃冰箱保存备用。

步骤2，将scp-2蛋白基因scp2插入载体pcdfduet-1：

(1)分别采用ncoi与ecori两种限制性内切酶分别对载体pcdfduet-1进行双酶切并回收；

酶切反应体系与条件，除将加入的质粒pucsp替换为载体pcdfduet-1外，其它条件同步骤1中所述酶切反应体系，酶切反应后获得一条3744bp的条带，采用凝胶电泳回收并测定浓度。

(2)采用t4连接酶将scp-2蛋白基因scp2与载体pcdfduet-1连接，得到质粒pcdsp；

连接反应体系：10×t4buffer，2μl；t4ligase，1μl；scp-2蛋白基因scp2，6μl；pcdfduet-1，2μl；ddh2o，9μl；总体积为20μl。

反应条件：在16℃下保温12h。

(3)将连接产物质粒pcdsp转入大肠杆菌dh5α：

①取10μl连接反应体系的反应液加入至100μl大肠杆菌dh5α的感受态细胞中轻轻混匀，冰上放置30min，得到混合液a；

②将混合液a放入42℃的水浴中热击90s，之后冰上放置3min；

③之后向混合液a中加入700μllb液体培养基，并于37℃培养箱中放置50min，得到混合液b；

④对混合液b进行5min的6000g离心，之后收集菌体，吸出650μl上清液，将沉淀与剩余的上清液混合均匀后涂布于含50mg/l氨苄青霉素的lb固体培养基上。

步骤3，质粒pcdsp的筛选与验证：

于lb固体培养基上挑取阳性单克隆，利用设计的验证引物check__pcdsp_up和check__pcdsp_down进行菌落pcr验证，含有质粒pcdsp的单克隆在菌落pcr验证后将获得一条2134bp的扩增条带；随后将该扩增条带的单克隆接种于含氨苄青霉素的lb液体培养基，在37℃下培养16h后提取质粒；最后对提取的质粒进行双酶切、测序验证，验证原理如图3所示。

(1)验证引物的设计与合成；

check_pcdaf_up：5’-ggatctcgacgctctccctt-3’(该序列对应序列1的第41-60位)

check_pcdsp_down：5’-atgctagttattgctcagcggt-3’(该序列为序列3的第2153-2174位的反向互补序列)

(2)菌落pcr验证；

pcr反应体系：extaqmix，25μl；check_pcdsp_down(10μm)，1μl；check_pcdsp_down(10μm)，1μl；ddh2o，23μl；pcr反应体系的总体积为50μl，采用20μl枪头挑取单克隆混入pcr反应体系组成的pcr反应液中。

pcr反应条件：先在98℃下进行3min保温；再依次循环32次以下过程：98℃下保温10s，62℃下保温30s，72℃下保温2.5min，72℃下保温5min；最后保持4℃的反应条件。

pcr结果：pcr反应液进行凝胶电泳后获得一条2134bp的条带，结果如图4所示。

(3)将获得扩增条带的单克隆接种于含有50mg/l氨苄青霉素的lb液体培养基中，于37℃下培养16h，得到培养菌液；

(4)取上述培养菌液3ml并提取质粒pcdsp；

(5)双酶切验证质粒pcdsp：

酶切反应体系为：10×qcbuffer，10μl；ncoi，2μl；ecori，2μl；pcdsp，20μl；ddh2o，66μl；总体积为100μl。

酶切反应条件为：37℃水浴锅放置2h；

实验结果为：酶切反应液进行凝胶电泳后分别获得一条1649bp(scp-2蛋白基因scp2)和一条3738bp(pcdfduet-1)的条带，证明scp-2蛋白基因scp2被成功插入载体pcdfduet-1，表明质粒pcdsp构建成功，双酶切结果如图5所示。

应用质粒pcdsp提高大肠杆菌中的角鲨烯含量：

步骤1，重组菌e.colicssp1的构建：

(1)重组菌e.colicsq1感受态细胞的制备：

①野生菌株e.colic43(de3)感受态细胞的制备：先将野生菌株e.colic43(de3)接种于10mllb培养液中，于37℃下振荡培养3h使菌体的密度达到od600＝0.4，得到溶液a；之后将溶液a冰浴10min，之后进行5min的4000g离心，最后收集菌体；然后将收集的菌体重悬于10ml的cacl2(50mmol/l)溶液中，冰浴10min，再次进行5min的4000g离心，收集菌体；最后将收集的菌体再次重悬于2ml预冷的cacl2溶液(50mmol/l)中，使菌液浓缩，继续冰浴15min，使菌体受敏成感受态细胞，得到野生菌株e.colic43(de3)感受态细胞。

②质粒ptsqs转入野生菌株e.colic43(de3)感受态细胞中：先取1μl质粒ptsqs加入至100μl野生型菌株e.colic43(de3)感受态细胞中轻轻混匀，冰上放置30min，得到混合液b；之后将混合液b在42℃下进行90s的水浴热击，并将其放置于冰上3min，然后往混合液b中加入700μllb液体培养基得到混合液c，并于37℃培养箱放置50min，最后对混合液c进行5min的6000g离心，收集菌体，吸出650μl的上清液，将沉淀与剩余的上清液混合均匀后涂布于含50mg/l氨苄青霉素的lb固体培养基上，筛选获得重组菌e.colicsq1。

③先将重组菌e.colicsq1接种于10mllb培养液中，于37℃下振荡培养3h使菌体密度达到od600＝0.4，得到溶液d，之后将溶液d冰浴10min，之后进行5min的4000g离心，最后收集菌体；然后将收集的菌体重悬于10ml的cacl2(50mmol/l)溶液中，冰浴10min，再次进行5min的4000g离心，再次收集菌体；最后将收集的菌体再次重悬于2ml预冷的cacl2溶液(50mmol/l)中，使菌液浓缩，继续冰浴15min，使菌体受敏成感受态细胞，得到重组菌e.colicsq1感受态细胞。

(2)质粒pcdsp转入重组菌e.colicsq1：

①先取1μl质粒pcdsp加入至100μle.colicsq1感受态细胞中轻轻混匀，冰上放置30min，得到混合液e；之后将混合液e在42℃下进行90s的水浴热击，并将其放置于冰上3min；

③然后向混合液e中加入700μllb液体培养基得到混合液f，并于37℃培养箱放置50min；

④最后对混合液f进行5min的6000g离心，收集菌体，吸出650μl上清液，将沉淀与剩余的上清液混合均匀后涂布于同时含50mg/l氨苄青霉素与50mg/l链霉素的lb固体培养基上，筛选获得重组菌e.colicssp1。

步骤2.蛋白表达及角鲨烯的提取：

(1)将e.colicsq1接种至含50mg/l氨苄青霉素lb液体培养基，将e.colicssp1接种至含50mg/l氨苄青霉素与50mg/l链霉素的lb液体培养基，于37℃下培养3h至菌体的浓度达到od600＝0.3，加入终浓度为0.5mm的iptg诱导蛋白表达；

(2)重组菌e.colicssp1及重组菌e.colicsq1中角鲨烯的提取；

分别对重组菌e.colicssp1及重组菌e.colicsq1做以下相同的提取处理，方法如下：

①取20ml菌液，然后对其进行5min的12000g离心，之后倒掉上清液，加入20mlddh2o重悬菌体，再次进行5min的12000g离心并倒掉上清液，重复2次收集得到菌泥；

②将收集的菌泥放入离心管中，冷冻干燥过夜；

③往离心管中加入5ml60％氢氧化钾/水溶液(w/v)，7.5ml甲醇，7.5ml0.5％焦性没食子酸/甲醇溶液(w/v)，最后放入45℃摇床150rpm温育10h；

④往离心管中加入10ml己烷并震荡5min，用分液漏斗分离收集上层己烷，重复三次，将所有己烷收集到同一个新的50ml离心管中；

⑤往己烷中加入5g无水na2so4，在通风橱中于40℃下蒸干己烷，得到固体粗提物。

(3)hplc法分析角鲨烯合成，按照以下步骤依次进行：

①将上述固体粗提物溶解于1ml甲醇/二氯己烷(9:1，v/v)中；

②采用0.22μm孔径的有机系无菌滤膜过滤甲醇/二氯己烷溶液；

③通过hplc法对标准品、重组菌e.colicssp1的提取物及重组菌e.colicsq1的提取物分别进行检测分析，检测条件：柱体为c18，柱温为40℃，样品注入体积为10μl，流动相为甲醇/水溶液(9:1，v/v)，流速为1.0ml/min；

④将标准品、重组菌e.colicssp1的提取物及重组菌e.colicsq1的提取物的检测结果进行对比分析，结果如图6所示。

结果显示，由标准品的分析证明了角鲨烯合成的出峰时间约为27.2min(图6中a)。同样干重的细胞条件下，重组菌e.colicsq1的提取物与重组菌e.colicssp1的提取物在27.2min附近均出现一个吸收峰，但是重组菌e.colicsq1的吸收峰(图6中b)明显低于重组菌e.colicssp1的吸收峰(图6中c)。换算结果显示，重组菌e.colicsq1中角鲨烯含量为0.74mg/g(细胞干重，dcw)而重组菌e.colicssp1中角鲨烯的含量为1.17mg/gdcw。结果证明，重组菌e.colicssp1中scp-2蛋白的表达使角鲨烯含量提高了58％。

序列表

<110>西安医学院

<120>提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pcdsp及其制备和使用方法

<130>2018

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>5387

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctccctt60

atgcgactcctgcattaggaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataa120

caattcccctgtagaaataattttgtttaactttaataaggagatataccatgggcccgt180

ctgttgctctgaactctccgcgtctgcgtcgtgttttcgttgttggtgttggtatgacca240

aattcatgaaaccgggtggtgaaaactctcgtgactacccggacctggctaaagaagctg300

gtcagaaagctctggctgacgctcagatcccgtactctgctgttgaacaggcttgcgttg360

gttacgtttacggtgaatctacctgcggtcagcgtgctatctaccactctctgggtctga420

ccggtatcccgatcatcaacgttaacaacaactgctctaccggttctaccgctctgttca480

tggctcagcagctggttcagggtggtctggctaactgcgttctggctctgggtttcgaaa540

aaatggaaaaaggttctctgggtactaaatactctgaccgttctaacccgctggaaaaac600

acatcgacgttctgatcaacaaatacggtatgtctgcttgcccgttcgctccgcagctgt660

tcggttctgctggtaaagaacacatggaaacctacggtactaaagttgaacacttcgcta720

aaatcggttggaaaaaccacaaacactctgttaacaacccgtactctcagttccaggacg780

aatactctctggacgaaatcatgaaatctcgtccggttttcgacttcctgaccgttctgc840

agtgctgcccgacctctgacggtgctgctgctgctatcgtttcttctgaagaatttgttc900

agaaacacggtctgcagtctaaagctgttgaaatcgttgctcaggaaatggttaccgaca960

tgccgtctaccttcgaagaaaaatctgttatcaaaatggttggttacgacatgtctaaag1020

aagctgctcgtaaatgctacgaaaaatctggtctgggtccgtctgacgttgacgttatcg1080

aactgcacgactgcttctctaccaacgaactgctgacctacgaagctctgggtctgtgcc1140

cggaaggtcagggtggtgctctggttgaccgtggtgacaacacctacggtggtaaatggg1200

ttatcaacccgtctggtggtctgatctctaaaggtcacccgctgggtgctaccggtctgg1260

ctcagtgcgctgaactgtgctggcagctgcgtggtgaagctggtaaacgtcaggttccgg1320

gtgctaaagttgctctgcagcacaacctgggtctgggtggtgctgctgttgttaccctgt1380

accgtatgggtttcccggaagctgcttcttctttccgtacccaccagatctctgctgctc1440

cgacctcttctgctggtgacggtttcaaagctaacctgatcttcaaagaaatcgaaaaaa1500

aactggaagaagaaggtgaagaatttgttaaaaaaatcggtggtatcttcgctttcaaag1560

ttaaagacggtccgggtggtaaagaagctacctgggttgttgacgttaaaaacggtaaag1620

gttctgttctgccggactctgacaaaaaagctgactgcaccatcactatggctgactctg1680

acctgctggctctgatgaccggtaaaatgaacccgcagtctgctttcttccagggtaaac1740

tgaaaatcgctggtaacatgggtctggctatgaaactgcagtctctgcagctgcagccgg1800

acaaagctaaactgtaagaattcgagctcggcgcgcctgcaggtcgacaagcttgcggcc1860

gcataatgcttaagtcgaacagaaagtaatcgtattgtacacggccgcataatcgaaatt1920

aatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattccccatcttagtatattag1980

ttaagtataagaaggagatatacatatggcagatctcaattggatatcggccggccacgc2040

gatcgctgacgtcggtaccctcgagtctggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaacg2100

ccagcacatggactcgtctactagcgcagcttaattaacctaggctgctgccaccgctga2160

gcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaa2220

acctcaggcatttgagaagcacacggtcacactgcttccggtagtcaataaaccggtaaa2280

ccagcaatagacataagcggctatttaacgaccctgccctgaaccgacgaccgggtcatc2340

gtggccggatcttgcggcccctcggcttgaacgaattgttagacattatttgccgactac2400

cttggtgatctcgcctttcacgtagtggacaaattcttccaactgatctgcgcgcgaggc2460

caagcgatcttcttcttgtccaagataagcctgtctagcttcaagtatgacgggctgata2520

ctgggccggcaggcgctccattgcccagtcggcagcgacatccttcggcgcgattttgcc2580

ggttactgcgctgtaccaaatgcgggacaacgtaagcactacatttcgctcatcgccagc2640

ccagtcgggcggcgagttccatagcgttaaggtttcatttagcgcctcaaatagatcctg2700

ttcaggaaccggatcaaagagttcctccgccgctggacctaccaaggcaacgctatgttc2760

tcttgcttttgtcagcaagatagccagatcaatgtcgatcgtggctggctcgaagatacc2820

tgcaagaatgtcattgcgctgccattctccaaattgcagttcgcgcttagctggataacg2880

ccacggaatgatgtcgtcgtgcacaacaatggtgacttctacagcgcggagaatctcgct2940

ctctccaggggaagccgaagtttccaaaaggtcgttgatcaaagctcgccgcgttgtttc3000

atcaagccttacggtcaccgtaaccagcaaatcaatatcactgtgtggcttcaggccgcc3060

atccactgcggagccgtacaaatgtacggccagcaacgtcggttcgagatggcgctcgat3120

gacgccaactacctctgatagttgagtcgatacttcggcgatcaccgcttccctcatact3180

cttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacat3240

atttgaatgtatttagaaaaataaacaaatagctagctcactcggtcgctacgctccggg3300

cgtgagactgcggcgggcgctgcggacacatacaaagttacccacagattccgtggataa3360

gcaggggactaacatgtgaggcaaaacagcagggccgcgccggtggcgtttttccatagg3420

ctccgccctcctgccagagttcacataaacagacgcttttccggtgcatctgtgggagcc3480

gtgaggctcaaccatgaatctgacagtacgggcgaaacccgacaggacttaaagatcccc3540

accgtttccggcgggtcgctccctcttgcgctctcctgttccgaccctgccgtttaccgg3600

atacctgttccgcctttctcccttacgggaagtgtggcgctttctcatagctcacacact3660

ggtatctcggctcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtaagcaagaactccccg3720

ttcagcccgactgctgcgccttatccggtaactgttcacttgagtccaacccggaaaagc3780

acggtaaaacgccactggcagcagccattggtaactgggagttcgcagaggatttgttta3840

gctaaacacgcggttgctcttgaagtgtgcgccaaagtccggctacactggaaggacaga3900

tttggttgctgtgctctgcgaaagccagttaccacggttaagcagttccccaactgactt3960

aaccttcgatcaaaccacctccccaggtggttttttcgtttacagggcaaaagattacgc4020

gcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctactgaaccgctctagattt4080

cagtgcaatttatctcttcaaatgtagcacctgaagtcagccccatacgatataagttgt4140

aattctcatgttagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctct4200

caagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgtt4260

gcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcgg4320

ccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcacca4380

gtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagc4440

ggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcggga4500

tataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatgtccgcaccaacgc4560

gcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaacca4620

gcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggaca4680

tggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatt4740

tatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcg4800

cgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcat4860

gggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaa4920

cattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatga4980

tcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgc5040

cgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaa5100

tcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatca5160

gcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccg5220

ccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcacca5280

cgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactg5340

gtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcat5387

<210>2

<211>1644

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atgccgtctgttgctctgaactctccgcgtctgcgtcgtgttttcgttgttggtgttggt60

atgaccaaattcatgaaaccgggtggtgaaaactctcgtgactacccggacctggctaaa120

gaagctggtcagaaagctctggctgacgctcagatcccgtactctgctgttgaacaggct180

tgcgttggttacgtttacggtgaatctacctgcggtcagcgtgctatctaccactctctg240

ggtctgaccggtatcccgatcatcaacgttaacaacaactgctctaccggttctaccgct300

ctgttcatggctcagcagctggttcagggtggtctggctaactgcgttctggctctgggt360

ttcgaaaaaatggaaaaaggttctctgggtactaaatactctgaccgttctaacccgctg420

gaaaaacacatcgacgttctgatcaacaaatacggtatgtctgcttgcccgttcgctccg480

cagctgttcggttctgctggtaaagaacacatggaaacctacggtactaaagttgaacac540

ttcgctaaaatcggttggaaaaaccacaaacactctgttaacaacccgtactctcagttc600

caggacgaatactctctggacgaaatcatgaaatctcgtccggttttcgacttcctgacc660

gttctgcagtgctgcccgacctctgacggtgctgctgctgctatcgtttcttctgaagaa720

tttgttcagaaacacggtctgcagtctaaagctgttgaaatcgttgctcaggaaatggtt780

accgacatgccgtctaccttcgaagaaaaatctgttatcaaaatggttggttacgacatg840

tctaaagaagctgctcgtaaatgctacgaaaaatctggtctgggtccgtctgacgttgac900

gttatcgaactgcacgactgcttctctaccaacgaactgctgacctacgaagctctgggt960

ctgtgcccggaaggtcagggtggtgctctggttgaccgtggtgacaacacctacggtggt1020

aaatgggttatcaacccgtctggtggtctgatctctaaaggtcacccgctgggtgctacc1080

ggtctggctcagtgcgctgaactgtgctggcagctgcgtggtgaagctggtaaacgtcag1140

gttccgggtgctaaagttgctctgcagcacaacctgggtctgggtggtgctgctgttgtt1200

accctgtaccgtatgggtttcccggaagctgcttcttctttccgtacccaccagatctct1260

gctgctccgacctcttctgctggtgacggtttcaaagctaacctgatcttcaaagaaatc1320

gaaaaaaaactggaagaagaaggtgaagaatttgttaaaaaaatcggtggtatcttcgct1380

ttcaaagttaaagacggtccgggtggtaaagaagctacctgggttgttgacgttaaaaac1440

ggtaaaggttctgttctgccggactctgacaaaaaagctgactgcaccatcactatggct1500

gactctgacctgctggctctgatgaccggtaaaatgaacccgcagtctgctttcttccag1560

ggtaaactgaaaatcgctggtaacatgggtctggctatgaaactgcagtctctgcagctg1620

cagccggacaaagctaaactgtaa1644

<210>3

<211>5502

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gtttgacagcttatcatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatc60

ggaagctgtggtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggc120

gcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattc180

tgaaatgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcgga240

taacaatttcacacaggaaacagaccatggatgggcggtaaactgctgcagctggctctg300

cacccggttgaaatgaaagctgctctgaaactgaaattctgccgtaccccgctgttctct360

atctacgaccagtctacctctccgtacctgctgcactgcttcgaactgctgaacctgacc420

tctcgttctttcgctgctgttatccgtgaactgcacccggaactgcgtaactgcgttacc480

ctgttctacctgatcctgcgtgctctggacaccatcgaagacgacatgtctatcgaacac540

gacctgaaaatcgacctgctgcgtcacttccacgaaaaactgctgctgaccaaatggtct600

ttcgacggtaacgctccggacgttaaagaccgtgctgttctgaccgacttcgaatctatc660

ctgatcgaatttcacaaactgaaaccggaataccaggaagttatcaaagaaatcaccgaa720

aaaatgggtaacggtatggctgactacatcctggacgaaaactacaacctgaacggtctg780

cagaccgttcacgactacgacgtttactgccactacgttgctggtctggttggtgacggt840

ctgacccgtctgatcgttatcgctaaattcgctaacgaatctctgtactctaacgaacag900

ctgtacgaatctatgggtctgttcctgcagaaaaccaacatcatccgtgactacaacgaa960

gacctggttgacggtcgttctttctggccgaaagaaatctggtctcagtacgctccgcag1020

ctgaaagacttcatgaaaccggaaaacgaacagctgggtctggactgcatcaaccacctg1080

gttctgaacgctctgtctcacgttatcgacgttctgacctacctggctggtatccacgaa1140

cagtctaccttccagttctgcgctatcccgcaggttatggctatcgctaccctggttctg1200

gttttcaacaaccgtgaagttctgcacggtaacgttaaaatccgtaaaggtactacctgc1260

tacctgatcctgaaatctcgtaccctgcgtggttgcgttgaaatcttcgactactacctg1320

cgtgacatcaaatctaaactggctgttcaggacccgaacttcctgaaactgaacatccag1380

atctctaaaatcgaacagttcatggaagaaatgtaccaggacaaactgccgccgaacgtt1440

aaaccgaacgaaaccccgatcttcctgaaagttaaagaacgttctcgttacgacgacgaa1500

ctggttccgacccagcaggaagaagaatacaaattcaacatggttctgtctatcatcctg1560

tctgttctgctgggtttctactacatctacaccctgcaccgtgcttaaggtacccgggga1620

tcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggctgttttggcggatgagagaagatt1680

ttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcct1740

ggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgt1800

agcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaat1860

aaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaa1920

cgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcc1980

cggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggc2040

catcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactctttttgtttatttttctaaata2100

cattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattga2160

aaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggca2220

ttttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagat2280

cagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgag2340

agttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggc2400

gcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattct2460

cagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgaca2520

gtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttactt2580

ctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcat2640

gtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgt2700

gacaccacgatgcctacagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaacta2760

cttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcagga2820

ccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggt2880

gagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatc2940

gtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgct3000

gagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatata3060

ctttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatccttttt3120

gataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagacccc3180

gtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttg3240

caaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaact3300

ctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtg3360

tagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctg3420

ctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggac3480

tcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcaca3540

cagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatga3600

gaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc3660

ggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcct3720

gtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcgg3780

agcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcct3840

tttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcc3900

tttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagc3960

gaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttca4020

caccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtat4080

acactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccg4140

ctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccg4200

tctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagc4260

agatcaattcgcgcgcgaaggcgaagcggcatgcatttacgttgacaccatcgaatggtg4320

caaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggggtgaat4380

gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtt4440

tcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcg4500

gcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacag4560

tcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtc4620

gcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaa4680

cgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagt4740

gggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgc4800

actaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattatt4860

ttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccag4920

caaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggc4980

tggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactgg5040

agtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccact5100

gcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtcc5160

gggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctca5220

tgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagc5280

gtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgccc5340

gtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgc5400

gcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcag5460

tgagcgcaacgcaattaatgtgagttagcgcgaattgatctg5502

<210>4

<211>1338

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

atgggcggtaaactgctgcagctggctctgcacccggttgaaatgaaagctgctctgaaa60

ctgaaattctgccgtaccccgctgttctctatctacgaccagtctacctctccgtacctg120

ctgcactgcttcgaactgctgaacctgacctctcgttctttcgctgctgttatccgtgaa180

ctgcacccggaactgcgtaactgcgttaccctgttctacctgatcctgcgtgctctggac240

accatcgaagacgacatgtctatcgaacacgacctgaaaatcgacctgctgcgtcacttc300

cacgaaaaactgctgctgaccaaatggtctttcgacggtaacgctccggacgttaaagac360

cgtgctgttctgaccgacttcgaatctatcctgatcgaatttcacaaactgaaaccggaa420

taccaggaagttatcaaagaaatcaccgaaaaaatgggtaacggtatggctgactacatc480

ctggacgaaaactacaacctgaacggtctgcagaccgttcacgactacgacgtttactgc540

cactacgttgctggtctggttggtgacggtctgacccgtctgatcgttatcgctaaattc600

gctaacgaatctctgtactctaacgaacagctgtacgaatctatgggtctgttcctgcag660

aaaaccaacatcatccgtgactacaacgaagacctggttgacggtcgttctttctggccg720

aaagaaatctggtctcagtacgctccgcagctgaaagacttcatgaaaccggaaaacgaa780

cagctgggtctggactgcatcaaccacctggttctgaacgctctgtctcacgttatcgac840

gttctgacctacctggctggtatccacgaacagtctaccttccagttctgcgctatcccg900

caggttatggctatcgctaccctggttctggttttcaacaaccgtgaagttctgcacggt960

aacgttaaaatccgtaaaggtactacctgctacctgatcctgaaatctcgtaccctgcgt1020

ggttgcgttgaaatcttcgactactacctgcgtgacatcaaatctaaactggctgttcag1080

gacccgaacttcctgaaactgaacatccagatctctaaaatcgaacagttcatggaagaa1140

atgtaccaggacaaactgccgccgaacgttaaaccgaacgaaaccccgatcttcctgaaa1200

gttaaagaacgttctcgttacgacgacgaactggttccgacccagcaggaagaagaatac1260

aaattcaacatggttctgtctatcatcctgtctgttctgctgggtttctactacatctac1320

accctgcaccgtgcttaa1338