物（详见实施例5)分别获得含5'端EcoRI 酶切位点的信号肽（Signal P印tide)、重链可变区（VH)、含TGA终止密码子和3'端BamH I酶切位点的重链恒定区（CH)基因片段，并以over-lapping PCR方法将三段联接，获得 GB235-094抗体的重链全长基因片段。以相同方法获得GB235-094抗体含信号肽（Signal Peptide)、轻链可变区（VL)和轻链恒定区（CL)的轻链全长基因片段。利用EcoR I和BamH I酶切形成的粘性末端分别将重链和轻链全长基因片段克隆至PGEM-T载体。
[0025] 图2显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-094的SDS-PAGE电泳结果图。将纯化 得到的68235-094抗体和赫赛汀对照样品在50禮二硫苏糖醇还原条件下经10%聚丙烯酰 氨凝胶电泳解析，结果显示GB235-094抗体和赫赛汀均呈现分子量为50KDa和25KDa的两 条带，分别为抗体的重链和轻链。
[0026] 图3显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-094与人HER2抗原的结合结果图。以 重组人HER2抗原包被ELISA板，以不同浓度的GB235-094抗体和赫赛汀与包被于板上的抗 原分子结合，并以HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体测定结合的抗体。结果显示与赫赛汀一样， GB235-094抗体可结合于人HER2,并呈现出浓度依赖性和可饱和性。
[0027] 图4A显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-094与猴HER2抗原的结合结果图。 以重组猴HER2抗原包被ELISA板，以不同浓度的GB235-094抗体和赫赛汀与包被于板上的 抗原分子结合，并以HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体测定结合的抗体。结果显示与赫赛汀一 样，GB235-094抗体可结合于猴HER2,并呈现出浓度依赖性和可饱和性。
[0028] 图4B显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-094与小鼠HER2抗原缺乏免疫反应 性。在用ELISA测定GB235-094抗体与猴HER2免疫反应性的同时，以重组小鼠HER2抗原 包被ELISA板，以不同浓度的GB235-094抗体和赫赛汀与包被于板上的抗原分子结合，并以 HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体测定结合的抗体。结果显示赫赛汀与小鼠HER2无交叉反应， 而GB235-094抗体在10 y g/mL浓度条件下可结合于小鼠HER2。
[0029] 图5显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-094与人HER家族其它成员人HER1、 HER3、HER4的结合实验结果图。以重组人HER1、HER2、HER3和HER4抗原分别包被ELISA板， 以GB235-094抗体和赫赛汀（均为10 y g/mL)与包被于板上的抗原分子结合，并以HRP标 记的羊抗人IgG Fc抗体测定结合的抗体。结果显示与赫赛汀一样，GB235-094抗体可结合 于人的HER2,与其他HER家族成员分子没有免疫反应性。
[0030] 图6显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-094与赫赛汀表位竞争的结果图。用 ELISA方法，以重组人HER2抗原包被ELISA板，以不同浓度的GB235-094抗体和赫赛汀分 别与生物素标记的赫赛汀（0. 005 y g/mL固定浓度）共同室温孵育2小时后和HER2包被 的板结合，并用HRP标记的抗生物素抗体检测结合的抗体。结果显示，随赫赛汀浓度增加， 生物素标记的赫赛汀在HER2上的结合受到抑制。在实验涉及的最高浓度（10 yg/mL)下， GB235-094抗体对生物素标记赫赛汀在HER2上的结合有部分抑制。
[0031] 图7显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-094与BT-474细胞的结合曲线结果 图。将表达中等水平的J1ER2和表达高水平的P-HER2的BT-474乳腺癌细胞在96-孔U型 板中分别与不同浓度的GB235-094抗体和赫赛汀孵育，在充分洗涤后，以HRP标记的羊抗人 Fc抗体检测结合抗体。结果显示，GB235-094抗体和赫赛汀一样可结合于表达HER2的细胞 表面，且呈现出浓度依赖性和可饱和性，提示GB235-094抗体对HER2有高度选择性。
[0032] 图8A显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-094体外抑制BT-474细胞增殖活性 的实验结果。将HER2高表达的BT-474乳腺癌细胞在96-孔U型板中分别与4和20 y g/mL 的GB235-094抗体和赫赛汀孵育72小时后用Alarmar Blue测定细胞活性。结果显示，两 个抗体在两种浓度下均能明显抑制BT-474细胞增殖，且两个浓度抑制作用相当。
[0033] 图8B显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-094体外抑制BT-474细胞增殖活性的 量效关系。将表达中等水平的HER2和表达高水平的P-HER2的BT-474乳腺癌细胞在96-孔 平底型板中分别与2和10 y g/mL的GB235-094抗体和赫赛汀孵育72小时后用Alarmar Blue测定细胞活性。结果显示，GB235-094抗体和赫赛汀对BT-474细胞的增殖抑制均呈现 出浓度依赖性，GB235-094抗体的抑制作用略微弱于赫赛汀。
[0034] 图9显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-094体外抑制BT-474细胞增殖的活性 可被可溶性人J1ER2抗原翻转。将表达中等水平的HER2和表达高水平的P-HER2的BT-474 乳腺癌细胞在96-孔平底板中分别与不同浓度的GB235-094抗体和赫赛汀孵育72小时，或 在各抗体浓度条件下加入100 U g/mL的重组人HER2抗原，并孵育72小时，用Alarmar Blue 测定细胞活性。结果显示，与空白对照相比，在两个抗体在两种浓度下均能明显抑制BT-474 细胞增殖，且两个浓度抑制作用相当。在存在可溶性人ffiR2抗原的条件下，高浓度抗体对 细胞增殖的抑制作用部分被翻转，低浓度抗体对细胞增殖的作用完全被翻转，提示抗体对 肿瘤细胞增殖的抑制作用是J1ER2特异性的。
[0035] 图10A、图10B、图10C分别显示了重组全长抗人HER2抗体GB235-094体外作用 BT-474细胞2小时、24小时、72小时后的P-HER2、P-Akt、P-ERKl/2蛋白表达结果图。将表 达中等水平的HER2和表达高水平的P-HER2的乳腺癌细胞BT-474在含10 %胎牛血清培养 基中与2和20 y g/mL赫赛汀和GB235-094抗体孵育，并分别于2、24和72小时取样。以细 胞裂解液做免疫印迹，以相应抗体分别探测全部和磷酸化的HER2、ERKl/2和Akt。图10A的 结果显示，在抗体作用2小时的情况下，与对照组相比，20 y g/ml和2 y g/ml的赫赛汀均可 引起P-HER2和P-Akt的下调，而GB235-094抗体对P-Akt的下调作用不明显，对P-HER2有 轻微的上调作用。图10B的结果显示，在24小时的作用条件下，赫赛汀对P-HER2和P-Akt 的下调作用与2小时的一致，而GB235-094抗体对P-HER2有上调作用，但对P-Akt无明显作 用。图10C的结果显示，在作用72小时的条件下，20 y g/ml和2 y g/ml的赫赛汀对P-HER2、 P-Akt和P-ERK1/2都产生了明显的下调作用。而GB235-094抗体对P-Akt没有明显的作 用，对P-HER2有明显的上调作用，无论是在20 y g/ml还是2 y g/ml，对P-ERK1/2的下调作 用都很明显。
【具体实施方式】
[0036] 本文所用的术语"抗体"是能够通过至少一个抗原识别位点，和靶分子（包括糖、 多聚核酸、脂类、多肽等）特异结合的免疫球蛋白。完整的抗体由两个相同的轻链（L)和两 个相同的重链（H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键和重链相连，而不同免疫球蛋白同 种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链 的一端有可变区（VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区（VL)，另一端有恒定 区；轻链的恒定区和重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区和重链的可变区相对。特殊的 氨基酸残基在轻链的重链的可变区之间形成界面。
[0037] 本文所用的术语"可变区"表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形 成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个可 变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区（CDR)或超变区中的三个片段中。 可变区较保守的部分称为构架区（FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包括四个FR区，它 们大致上呈折叠构型，由形成连接环的三个⑶R区相连，在某些情况下可形成部分0 折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR -起形成抗