体的 抗原结合部位（参见Kabat等，NIH Publ.No. 91-3242,卷1，647-669页（1991)。恒定区不 直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗 体的细胞毒性。
[0038] 脊椎动物抗体（免疫球蛋白）的"轻链"可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显 不同的两类（称为k和X)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以 分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步 分为亚类（同类型），如IgGl，IgG2, IgG3, IgG4, IgAl和IgA2。对应于不同免疫球蛋白重 链恒定区分别称为a、0、e、y、y。不同免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周 知的。
[0039] 本文所用的"全人源抗体"是指抗体基因来源人类的抗体。
[0040] 本文中，所谓"抗体"不但包括完整的多克隆或者单克隆抗体，也包括各种抗体片 段（如Fab、Fab'、F(ab'）2、Fv)，单链抗体（scFv)，由抗体片段形成的多特异性抗体，含有抗 体片段的融合蛋白，以及任何经过改造但包含所需特异性识别位点的免疫球蛋白分子。抗 体的来源或者制备方法并不受限制，例如通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物 等。
[0041] 下面将结合实施例进一步详细地描述本发明，然而应该理解，列举这些实施例只 是为了说明本发明，而不是用来限制本发明。下列实施例中未特别指明的浓度为质量百分 比浓度；未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，《分子克隆 实验指南》（New York :Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按 照制造厂商所建议的条件。本发明中未说明来源的溶剂和试剂均为普通市售品。
[0042] 实施例1从全人源scFv卩莖菌体文库中筛选scFv的阳性克隆
[0043] 人HER2 (胞外域）-Fc融合蛋白（下文称为hHER2-Fc)抗原（购自Sino Biological 公司，货号：10004-H02H)用磷酸盐缓冲液 PBS(0.01M Na2HP04 ? 12H20+0.002M KH2P04+0. 14M NaCl+0.002M 1((：1卬11 = 8.6)稀释至5 1^/1111，按照10〇111/孔加入酶标板中， 4°〇包被过夜。？831'(含0.05%吐温20的？83缓冲液）洗板4次后加入5%834(牛血清 白蛋白，货号：A7030,购自Sigma公司）300 yl/孔，37°C封闭1小时。再用PBST洗板2次。 将含有7 X 101(|个独立克隆的全人源scFv噬菌体抗体文库（此抗体库由优瑞科（北京）生 物技术有限公司以多个健康人淋巴细胞的抗体可变区基因与人工合成的重链CDR3基因组 合构建而成）的悬液按照100 U 1/孔加入酶标板中，在37°C条件下孵育2小时。吸出噬菌 体悬液，加入PBST充分吹打5分钟。在第一轮淘选过程中，PBST吹打一遍，在第二轮和第 三轮淘选中，PBST分别进行五遍和十遍的吹打，以去除非特异性的结合。加入含0. 1% BSA 的〇. 2M甘氨酸-盐酸（pH = 2. 2)洗脱液，室温孵育10分钟后，充分地吹打，洗脱阳性克隆 的噬菌体。将洗脱下的阳性克隆的噬菌体悬液用1M Tris-HCL(pH = 9. 1)缓冲液中和至中 性，感染对数期的大肠杆菌（购自Lucigen公司，货号：60502-1)并扩增，用于下一轮淘选 (第一、二轮）。第三轮淘选时，需将洗脱液进行梯度稀释并感染对数期宿主菌，在带氨苄 (Amp)抗性的LB琼脂培养皿上分离出单克隆来，用于单克隆鉴定及质粒保存。
[0044] 实施例2scFv噬菌体阳性克隆的酶联免疫吸附法（ELISA)鉴定
[0045] hHER2-Fc抗原用PBS (pH = 8. 6)稀释至2yg/ml，按照100y1/孔加入酶标板中， 4°C包被过夜。PBST洗板4次后加入5% BSA 300 y 1/孔，37°C封闭1小时。再用PBST洗 板2次，加入100 y 1/孔噬菌体阳性克隆悬液，在37°C条件下孵育2小时。PBST洗板4次， 加入HRP(辣根过氧化物酶）标记的抗M13噬菌体抗体（购自GE公司，货号：27-9421-01， PBST按1:5000稀释，100 y 1/孔），室温孵育1小时。PBST洗板4次，加入100 y 1/孔显色 液（可溶型单组分TMB底物溶液，购自Tiangen公司，货号：PA107-01)，室温孵育15分钟 显色，加入50yl/孔终止液（1M硫酸），在多功能酶标仪（Model 680Micro reader，购自 Bio-Rad公司）上450/630nm波长下读出吸光值。
[0046] 结果显示，经过三轮筛选，共获得1312种全人源scFv，可与hHER2-Fc抗原特异性 结合的scFv噬菌体阳性克隆有499种。经DNA测序，这些阳性克隆中有102种核苷酸/氨 基酸序列均不相同的scFv (如表1所示）。
[0047]表1.
[0048]
【主权项】
1. 一种全人源的HER2抗体，其中重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，轻链可变 区的氨基酸序列为SEQ ID N0:2。
2. 权利要求1的全人源HER2抗体，其是Fab、Fab'、F(ab'）2、Fv或scFv的形式。
3. 权利要求1的全人源HER2抗体，还包括人IgG的重链恒定区和轻链恒定区；优选地， 所述人IgG为IgGl;更优选地，所述人IgG重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID N0:5,所述 人IgG轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID N0:6。
4. 编码权利要求1-3任一项的全人源HER2抗体的核苷酸序列；优选地，在所述核苷酸 序列中，编码所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID N0:3,编码所述轻链可变区的核苷酸 序列为 SEQ ID NO:4。
5. 权利要求4的编码全人源HER2抗体的核苷酸序列，其中当所述全人源HRE2抗体包 含重链恒定区和轻链恒定区时，编码所述重链恒定区的核苷酸序列为SEQ ID N0:7,编码所 述轻链恒定区的核苷酸序列为SEQ ID N0:8。
6. -种包含权利要求4的核苷酸序列的表达载体，所述核苷酸序列与所述表达载体的 表达控制序列可操作地连接；优选地，所述表达载体为pGEM-Τ载体或293载体。
7. -种药物组合物，其包含权利要求1-3任一项的全人源HER2抗体和可药用载体。
8. -种联合药物，其包含权利要求1-3任一项的全人源HER2抗体和赫赛汀。
9. 一种检测人HER2的试剂盒，其包含权利要求1-3任一项的全人源HER2抗体。
10. 权利要求1-3任一项的全人源HER2抗体用于制备用于治疗受试者中的HER2阳性 肿瘤的药物的用途；优选地，所述HER2阳性的肿瘤选自HER2阳性的乳腺癌、胃癌、肺癌、非 小细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、 肛门区癌、结肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠 癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状芳腺癌、肾上腺癌、软组织癌、尿道癌、阴莖癌、前列腺癌、 膀胱癌、肾或尿道癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆囊癌、慢性或急性白血病、淋 巴细胞淋巴瘤、中枢神经系统（CNS)癌、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形式成胶质细胞瘤 (glioblastoma multiforme)，星形细胞瘤，神经鞘瘤，室管膜瘤，成神经管细胞瘤，脑膜 瘤、鳞状细胞瘤和垂体腺瘤；更优选地，所述受试者是人；最优选地，所述受试者是对赫赛 汀耐药或对赫赛汀无反应的人。
【专利摘要】本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种全人源HER2抗体、其编码基因及应用。本发明提供了一种全人源HER2抗体，其中重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。全人源HER2抗体可降低输液反应和免疫原性，提高药物安全性，具有更好的药物动力学特征。
【IPC分类】A61P35-00, A61P35-02, A61K39-395, G01N33-68, C07K16-28, C12N15-13, C12N15-63
【公开号】CN104650228
【申请号】CN201410696680
【发明人】周清, 舒孟军, 石姝, 言苏, 谭涛超
【申请人】嘉和生物药业有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2014年11月26日