8个左右。将收获的脾细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清，备用。
[0034]1.2.5细胞融合
[0035]无菌采取免疫小鼠脾脏，脾细胞与SP2/0细胞分别计数、离心后以不完全培养基重悬，脾细胞与SP2/0细胞数目以5:1比例加入50mL离心管内，混匀，室温1000r/min离心5min，弃去不完全培养基后轻拍离心管使细胞均匀贴附于管底，37°C水浴条件下在60s内缓慢滴加浓度为50%的PEG3350溶液lmL，此过程中轻轻转动离心管；PEG3350滴加完毕后静置离心管30s使细胞充分融合，然后由慢到快在2min内逐滴加入37°C预热的不完全培养液20mL终止融合；室温800r/min离心8min弃上清，适量37°C预热含HAT完全选择培养液悬浮细胞，加入到预先制备的含饲养细胞的96孔细胞培养板中培养。分别于融合后第3、7d用HAT选择培养基半量换液，第1d后改用HT培养基。待细胞集落体积达到1/3培养孔，取上清液用间接ELISA进行抗体检测。
[0036]1.2.6间接ELISA检测方法建立:
[0037](I)包被:重组Bac_VP60a和Bac_VP602蛋白用pH9.6CBS缓冲液稀释后，每孔200 μ g，包被酶标板，4°C过夜；
[0038](2)洗涤:以PBST (0.01M、ρΗ7.4的PBS缓冲液加入0.05 %的吐温20)作为洗涤液，将酶标板洗涤四次，每次间隔浸泡3min，扣干；
[0039](3)封闭:8% (w/v)的脱脂乳PBST溶液，250 μ L/孔，37°C封闭2h,同上洗涤、扣干；
[0040](4)检测:加入杂交瘤细胞培养物上清液，100 μ L/孔，37°C作用60min后洗涤、扣干；
[0041](5)加入1:30000稀释的羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG，100 μ L/孔，37°C作用Ih后洗涤、扣干；
[0042](6)显色:加TMB底物100 μ L/孔，37°C避光显色15min ；
[0043](7)终止:酶标板加入2M的H2S0450 μ L/孔终止显色，酶标仪读取0D490。
[0044]以重组蛋白VP60a作为免疫原制备的杂交瘤细胞株，针对重组Bac_VP60a蛋白作为检测抗原检测结果0D490值多2.0且对以重组蛋白Bac-VP602作为检测抗原的检测结果0D490值等同于阴性对照孔0D490值(约0.2)时，该杂交瘤细胞株作为单独识别RHDVa病毒的待选样品，进行下一步的亚克隆和筛选。以重组蛋白VP602作为免疫原制备的杂交瘤细胞株，针对重组Bac-VP602蛋白作为检测抗原检测结果0D490值多2.0且对以重组蛋白Bac-VP60a作为检测抗原的检测结果0D490值等同于阴性对照孔0D490值(约0.2)时，该杂交瘤细胞株作为单独识别RHDV2型病毒的待选样品，进行下一步的亚克隆和筛选。
[0045]1.2.7杂交瘤细胞筛选及克隆
[0046]当细胞集落体积长至1/3培养孔(1d左右)的时候，用间接ELISA检测细胞培养上清，筛选分泌阳性抗体的杂交瘤细胞，每孔重复检测三次。有限稀释法将所得阳性杂交瘤细胞进行三次亚克隆，有限稀释法进行亚克隆，程序如下:
[0047](I)制备饲养细胞悬液(同融合前)。
[0048](2)阳性孔细胞的计数并调整细胞数在I X 103?5X 103个/mL。
[0049](3)取130个细胞放入6.5mL含饲养细胞完全培养液，即20个/mL，100 μ L/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9mL细胞悬液补加2.9mL含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/mL，100 μ L/孔加D、E、F三排，为每孔I个细胞。余下2.2mL细胞悬液补加2.2mL含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/mL，100 μ L/孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。
[0050](4)培养4?5d后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液100 μ L/ 孔。
[0051](5)第8?9d时，肉眼可见细胞克隆(细胞集落体积长至1/3培养孔)，及时进行抗体检测。初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HAT。
[0052](6)按照上述方法连续克隆3次以上，直到所有的克隆细胞孔都为阳性。
[0053]能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，扩大培养后液氮冻存。
[0054]1.2.8杂交瘤细胞分泌的抗体分子的Western blot鉴定
[0055]将Bac_VP60a蛋白和和Bac_VP602蛋白经SDS-PAGE电泳后转膜，以杂交瘤细胞株的培养上清作为第一抗体，以HRP标记的羊抗鼠IgG作为第二抗体，DAB底物显色。
[0056]1.2.9杂交瘤细胞分泌的抗体分子的IFA鉴定
[0057]用rBacmid-VP60a和rBacmid_VP602感染Sf9细胞72h，弃细胞培养液，经多聚甲醛固定后，加入杂交瘤细胞株的培养上清作为第一抗体，以FITC标记的羊抗鼠IgG作为第二抗体，通过488nm波长荧光显微镜观察。
[0058]1.2.10杂交瘤细胞分泌的抗体分子的亚型鉴定
[0059]小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购自北京义翘神州生物技术公司，按照说明书对杂交瘤细胞株分泌的抗体分子亚型进行鉴定。
[0060]经连续3次克隆，获得能够分泌抗体分子并单独识别RHDVa型病毒的杂交瘤细胞株小鼠杂交瘤细胞(Mus musculus Hybridoma)McAb 1H2，该杂交瘤细胞株分泌的抗体分子可以识别RHDVa病毒粒子和重组Bac_VP60a蛋白，不识别Bac_VP602蛋白，差异极显著(P〈0.01)，如图3所示。获得能够分泌抗体分子并单独识别RHDV2的杂交瘤细胞株小鼠杂交瘤细胞(Mus musculus Hybridoma) McAb 1G2，该杂交瘤细胞株分泌的抗体分子不能够识别RHDVa病毒粒子和重组Bac-VP60a蛋白，仅识别Bac_VP602蛋白，差异极显著(P〈0.01)，如图4所示。
[0061]杂交瘤细胞株小鼠杂交瘤细胞(Mus musculus Hybridoma)McAb 1H2分泌的抗体分子可以识别重组Bac_VP60a蛋白，在70kDa处有特异条带，不识别Bac_VP602蛋白，无条带，如图5所示。杂交瘤细胞株小鼠杂交瘤细胞(Mus musculus Hybridoma)McAb 1G2分泌的抗体分子不能够识别重组Bac_VP60a蛋白，仅识别Bac_VP602蛋白，在70kDa处有特异条带，如图6所示。
[0062]杂交瘤细胞株小鼠杂交瘤细胞(Mus musculus Hybridoma)McAb 1H2分泌的抗体分子可以识别rBacmid-VP60a感染的Sf9细胞，不识别rBacmid_VP602感染的Sf9细胞(如图7所示)。杂交瘤细胞株小鼠杂交瘤细胞(Mus musculus Hybridoma)McAb 1G2分泌的抗体分子不能够识别rBacmid-VP60a感染的Sf9细胞，仅识别rBacmid_VP602感染的Sf9细胞(如图8所示)。
[0063]本发明杂交瘤细胞株McAb 1H2分泌的兔出血症RHDVa型病毒的单克隆抗体可以单独识别RHDVa型病毒和VP60a蛋白；该单克隆抗体分子重链为IgGl亚型，轻链为Kappa亚型(如图1所示)。
[0064]而杂交瘤细胞株McAb 1G2分泌的兔出血症RHDV2型病毒的单克隆抗体可以单独识别RHDV2型病毒和VP602蛋白；该单克隆抗体分子重链为IgG2a亚型，轻链为Kappa亚型(如图2所示)。
[0065]实验证明利用本发明兔出血症RHDVa型病毒的单克隆抗体可以准确的鉴别出患有兔出血症的兔子具体感染的是否为RHDVa型病毒。
【主权项】
1.杂交瘤细胞株McAb1H2，其特征在于其为小鼠杂交瘤细胞(Mus musculusHybridoma)McAb 1H2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.10317ο
2.兔出血症RHDVa型病毒单克隆抗体，其特征在于兔出血症RHDVa型病毒的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC N0.10317的杂交瘤细胞株McAb 1Η2产生。
【专利摘要】杂交瘤细胞株McAb 1H2及兔出血症RHDVa型病毒单克隆抗体，它涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体。它解决了目前没有能够单独识别RHDV2型病毒或RHDVa型病毒的单克隆抗体的问题。杂交瘤细胞株McAb 1H2保藏号为CGMCC No.10317。兔出血症RHDVa型病毒的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.10317的杂交瘤细胞株McAb 1H2产生。利用本发明兔出血症RHDVa型病毒的单克隆抗体可以准确的鉴别出患有兔出血症的兔子具体感染的是否为RHDVa型病毒，能够更有针对性的采取措施，对后期的免疫和防治具有深远的意义。CGMCC No.1031720150121
【IPC分类】C07K16-10, C12N5-20
【公开号】CN104694481
【申请号】CN201510149266
【发明人】刘家森, 曲连东, 姜骞, 郭东春, 刘大飞, 刘春国, 李志杰, 仇铮, 田进, 吴红霞, 刘明
【申请人】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年4月1日