ACACAGCAAAGCAGAAAC
[0087] E20-1-F：CACACTGACGTGCCTCTCC
[0088] E20-1-R：CTTCGCATGGTGGCCAGA
[0089] E20-2-1F：CCTCCCCGTATCTCCCT
[0090] E20-2-1R：GGAGATAAGGAGCCAGGAT
[0091] E21-1-F：AGCAGGGTCTTCTCTGTTTCA
[0092] E21-1-R：GAGGGACAGATCATCATGGG
[0093] E21-2-F：TTTCCTGACACCAGGGACC
[0094] E21-2-R：TGACCTAAAGCCACCTCCTT〇
[0095] 进一步地，所述环化采用的是夹板介导的单链DNA环化。
[0096] 进一步地，所述血浆DNA的EGFR基因具有插入、缺失、替换或基因融合突变。
[0097] 进一步地，其中所述的高通量测序方法选自所述高通量测序技术选自Roche/ 454FLX>Illumina/Hiseq/Miseq>AppliedBiosystemsSOLID和lifeTechnologies/ IonTorrent/Proton。
【附图说明】
[0098] 图1示本发明的实验设计。首先将血浆DNA预扩增，目的是增加检测产物的产量， 然后将预扩增产物DNA环化，目的是增加检测可利用的模板。针对EGFR基因进行扩增，制 作成可用于高通量测序的文库。
[0099] 图2本发明环化设计原理。预扩增产物DNA为两端含有通用接头的双链DNA，针对 两端的通用接头序列设计序列反向互补的夹板，退火杂交后形成局部双链区，经Taq连接 酶连接后形成单链环化产物。
[0100] 图3本发明环化效率。图为6%变性胶成像结果，1 :环化前PCR产物2:环化后产 物（未经外切酶消化）M:标记3 :环化后外切酶消化产物（未经纯化）4 :环化后外切酶消化 纯化产物。
[0101]图 4EGFR样品最终文库。2%琼脂糖胶结果。1 :LC2 ;2 :LC3 ;3 :LC113 ;4 :LC314 ; 5 :LC320 ;6 :NTC(阴性对照）。样品为肺癌（LungCancer，LC)样品。
【具体实施方式】
[0102] 随着测序技术进步，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，费用更 低、通量更高、速度更快、可完成全基因组测序的第二代测序技术应运而生。第二代测序技 术的核心思想是高通量的边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序 列，现有的技术平台主要包括Roche/ 454FLX、Illumina/GenomeAnalyzer/Hiseq/ Miseq、AppliedBiosysternsSOLID和lifeTechnologies/IonTorrent等。以Illumina 产品为例，HiSeq2000目前每个run可以达到6个人基因组30X覆盖的测序通量，约600G/ run数据，上机操作时间也减少到了 30分钟。而且随着第二代测序技术的成熟，将其应用于 临床的研究迅猛发展。研究表明通过测序孕妇血浆DNA可以判断胎儿遗传健康状况，而测 序检测者血浆DNA可以进行癌症早期筛查，并具有很强的应用前景。
[0103] 血浆DNA又称循环DNA，是血液中的细胞外DNA，长约几十到几百核苷酸（主峰约 167bp)，可以以DNA-蛋白质复合物的形式存在，也可以是游离的DNA片段。正常情况下，血 浆DNA来源于少量衰老死亡细胞的DNA释放。健康状态下，循环DNA的生成与清除处于动 态平衡状态，维持在较恒定的低水平，lmL血浆正常人约含有2000个基因组DNA的量。循环 DNA能反映人体内细胞新陈代谢的状况，是健康评判的一个重要指标。外周血循环DNA量和 质的改变与多种疾病（包括肿瘤、复合性严重外伤、器官移植、妊娠相关疾病、感染性疾病、 器官功能衰竭等）关系密切，作为一种无创性检测指标，有望成为某些疾病早期诊断、病情 监测、疗效及预后评估的一种重要的分子标志物。例如，研究发现，EGFR调控肿瘤细胞周期 进展、修复以及生存，同时亦与肿瘤转移有关。近年来，EGFR作为治疗靶标的分子靶向治疗 受到了国内外肿瘤界的普遍关注，其中EGFR酪氨酸激酶抑制剂Iressa(Genfitinib)已被 美国食品药品管理局（FDA)批准用于治疗晚期NSCLC。而分子靶点药物的突出特征是药物 疗效对靶点的依赖性特别强，对有"靶点"的患者治疗效果显著而无"靶点"的患者治疗效果 甚弱甚至毫无治疗效果，或因延误其它治疗而使病情恶化，因此未经靶点检测而盲目用药 不仅可能导致高额的经济损失，还可能会贻误宝贵的治疗时机，甚至导致病情恶化。快速准 确的判断出患者是否具有靶点药物治疗作用的特定靶点极为重要。传统EGFR检测主要通 过对病灶组织切片进行FISH或qPCR进行检测，而研究发现，NSCLC病人血浆中有较多的游 离DNA，约是正常人的10倍。大量血浆中游离DNA主要由凋亡和坏死的肿瘤细胞产生，其遗 传学特性与肿瘤基因组DNA相似，变异形式包括缺失、点突变、拷贝数增加。通过NSCLC病 人血浆DNA可检测出EGFR基因的变异，为无创的EGFR表达检测成为可能。本发明采用第 二代测序技术，检测血浆DNA中EGFR表达及变异，可实现快速、准确、无创、高灵敏检测，可 为患者提供各种诊断依据。
[0104] 鉴于通过血浆DNA测序无创检测的，临床意义和第二代高通量测序的快速发展， 本发明人发现大规模测序血浆DNA可更加快速准确无创的检测检测EGFR基因表达及变 异。其可适用于多种第二代高通量测序平台，包括但不限于Roche/ 454FLX、Illumina/ GenomeAnalyzer/Hiseq/Miseq>AppliedBiosystemsSOLID和lifeTechnologies/ IonTorrent等测序平台。
[0105] 本发明是基于以下的事实：患者血浆游离DNA遗传学特性与基因组DNA相似，且血 浆游离DNA含量高于正常人，常携带有大量突变，但每个突变点可能为低频突变；第二代高 通量测序可快速准确高通量获得血浆游离DNA信息。两者结合使得基因组特定区域检测便 于无创大规模应用。而研究表明，血浆DNA以片断化形式存在，含量低，lmL血浆约2000个基 因组；片断短，主要约167bp，这使得传统PCR方式很难高效的利用血浆DNA模板富集突变， 检测灵敏度迅速下降。本发明与传统方法不同，通过将DNA片断连接带有序列标签的接头， 扩增后进行单链环化，然后利用背靠背引物扩增的方式，最大限度的利用模板，将文库进行 高通量双端测序，由原始测序序列拼接出原始的扩增模板并记录标签序列，将比对到基因 组上位置相同并且标签序列一致的序列统计为一条模板，计算每对引物扩增出的模板数并 记录统计出的突变模板条数。本发明改进环化方式，针对EGFR基因做了引物优化设计，独 特的标签序列设计能有效降低背景，防止污染。并通计准确还原出体系内模板，统计唯一模 板集合，实现高准确率单分子检测。
[0106] 根据本发明的一个具体实施方案，提供了一种无创检测受试者中EGFR基因突变 的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1)针对EGFR基因外显子设计引物；（2)抽提受试者 血浆DNA; (3)将上述抽提的血浆DNA与标签接头连接；（4)将上述与标签接头连接的血浆 DNA进行PCR预扩增；（5)将所述扩增后的DNA进行环化，得到环化DNA; (6)利用所述引 物对所述环化DNA进行PCR扩增；以及（7)对所述PCR扩增的产物进行高通量测序并分析 EGFR基因的突变。本发明的无创检测的含义是指，相对于常规的直接针对癌症组织的手术 和组织活检等组织学检测方法需要造成受试者身体损伤的检测方法，本发明只需要通过受 试者的血样进行检测。传统检测DNA或基因片段的方法需要对待检测区域的进行PCR扩增 后在进行检测。因此，要求待检测区的DNA或基因片段式完整的，但是由于血浆DNA片段 大多数是不完整的，因此能够用于作为PCR扩增模板的DNA片段数量很少，常规的PCR很 难检测到。因此，本发明的PCR扩增使用了DNA环化技术，即使用接头序列和酶将片段DNA 变成一个环形。然后再针对待检测区设计引物。然后扩增并构建测序文库，使用高通量测 序技术进行测序，并分析EGFR基因的突变情况。图1示出了本发明的原理。首先将抽提血 浆DNA并连接标签接头。标签接头呈Y型，双链区含有用于区分不同模板的标签序列。为 了增加可扩增的DNA片段的数量，可以先进行预扩增，引物与接头上的通用序列退火。然后 对预扩增的DNA进行环化处理，如夹板式环化。图2示出了本发明的DNA环化原理，夹板序 列与预扩增引物区互补。然后，针对EGFR的外显子设计引物，例如针对外显子18,19, 20和 21设计引物并进行针对EGFR基因的特异性PCR扩增，得到测序文库。然后使用现在的高通 量测序技术队扩增的测序文库进行测序，得到所检测的EGFR基因特定区域，即外显子的基 因序列并分析其具体位点的基因突变情况。本发明所述的高通量是指现在使用的第二代 测序技术例如Roche/ 454FLX、Illumina/GenomeAnalyzer/Hiseq/Miseq、Applied BiosystemsSOLID和lifeTechnologies/IonTorrent等。不同平台在测序原理上存 在差别。以IlluminaMiseq为例，将制作完成的测序文库变性后，泵入Miseq测序仪进行 高通量测序，读长为双端250bp，每对引物位点产生约10万条测序序列。将双端序列依据 末端重复区域进行拼接成单端序列。查找单端序列中的接头区域，将序列还原为初始血浆 DNA片断，记录每条序列的标签序列。将还原后的DNA片断序列比对到人类基因组，记录序 列在基因组上的起始终止坐标。以起始终止坐标、标签序列为标准去除冗余，得到唯一模板 序列。目标区模板序列进行统计，得到突变类型、突变比例。
[0107] 在本发明的一个进一步的具体实施方案中，所述背向延伸的引物对中的引物均位 于所述EGFR基因外显子的5'端或3'端。进一步地，所述背向延伸的引物对之间间隔所述 片断DNA总碱基对的0-1 / 2。进一步地，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外显子18、 外显子19、外显子20、外显子21。进一步地，所述背向延伸的引物5'含有用于高通量测序 文库的接头序列。进一步地，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外显子18、外显子19、外 显子20或外显子21，其引物序列分别为：
[0108] E18-1-3F：CCCAGCTTGTGGAGCCTC
[0109] E18-1-3R：GACAAGAACACAGAGACAAGGGT
[0110] E18-2-F：GCAGGGCCTCTCATGGTC
[0111] E18-2-R：CCTGTGCCAGGGACCTTAC
[0112] E19-1-F：ACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCAT
[0113] E19-1-R：GTGAGATGGTGCCACATGCT
[0114] E19-2-F：GTCCATGGCTCTGAACCTCA
[0115] E19-2-R：CCACACAGCAAAGCAGAAAC
[0116] E20-1-F：CACACTGACGTGCCTCTCC
[0117] E20-1-R：CTTCGCATGGTGGCCAGA
[0118] E20-2-1F：CCTCCCCGTATCTCCCT
[0119] E20-2-1R：GGAGATAAGGAGCCAGGAT
[0120] E21-1-F：AGCAGGGTCTTCTCTGTTTCA
[0121] E21-1-R：GAGGGACAGATCATCATGGG
[0122] E21-2-F：TTTCCTGACACCAGGGACC
[0123] E21-2-R：TGACCTAAAGCCACCTCCTT〇
[0124] 进一步地，所述环化采用的是夹板介导的单链DNA环化。
[0125] 进一步地，其中所述的高通量二代测序方法选自所述高通量测序技术选自 Roche/ 454FLX、Illumina/Hiseq/Miseq、AppliedBiosystemsSOLID和life Technologies/IonTorrent/Proton。本发明使用了Illumina技术。
[0126