TCGACGTGGAGAGGCTCAGAGCCTGGCATGAACATGACCCTGAAT TCGGATGCAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCCCTCACAGCAGGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATGAACTACTTG GAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCAC AGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGC TTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCTGTATTGTTTAACACATGCAGG GGAGGATGCTCTCCAGACATTCTGGGTGAGCTCGCAGC
[0206] E21-1-F ：AGCAGGGTCTTCTCTGTTTCA
[0207] E21-1-R ：GAGGGACAGATCATCATGGG
[0208]E21-2-F ：TTTCCTGACACCAGGGACC
[0209]E21-2-R ：TGACCTAAAGCCACCTCCTT
[0210] 2?取2mL血浆抽提血浆游离DNA。
[0211] 3.末端补平
[0212] 制备如下的反应混合液
[0213]表1
【主权项】
1. 一种无创检测受试者中EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤： 针对EGFR基因外显子设计引物； 抽提受试者血浆DNA ; 将上述抽提的血浆DNA与标签接头连接； 将上述与标签接头连接的血浆DNA进行PCR预扩增； 将所述扩增后的DNA进行环化，得到环化DNA ; 利用所述引物对所述环化DNA进行PCR扩增；以及 对所述PCR扩增的产物进行高通量测序并分析EGFR基因的突变。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物是一对相邻且背向延伸的引物 对。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物对中的引物均位于 所述EGFR基因外显子的5'端或3'端。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物对之间间隔所述片 断DNA总碱基对的0-1 / 2。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外显 子18、外显子19、外显子20或外显子21。
6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物5'端含有用于高通 量测序文库的接头序列。
7. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外显 子18、外显子19、外显子20或外显子21，其引物序列分别为： E18-1-3F ：CCCAGCTTGTGGAGCCTC E18-1-3R ：GACAAGAACACAGAGACAAGGGT E18-2-F ：GCAGGGCCTCTCATGGTC E18-2-R ：CCTGTGCCAGGGACCTTAC E19-1-F ：ACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCAT E19-1-R ：GTGAGATGGTGCCACATGCT E19-2-F ：GTCCATGGCTCTGAACCTCA E19-2-R ：CCACACAGCAAAGCAGAAAC E20-1-F ：CACACTGACGTGCCTCTCC E20-1-R ：CTTCGCATGGTGGCCAGA E20-2-1F ：CCTCCCCGTATCTCCCT E20-2-1R ：GGAGATAAGGAGCCAGGAT E21-1-F ：AGCAGGGTCTTCTCTGTTTCA E21-1-R ：GAGGGACAGATCATCATGGG E21-2-F ：TTTCCTGACACCAGGGACC E21-2-R ：TGACCTAAAGCCACCTCCTT〇
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环化采用的是夹板介导的单链DNA环 化。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血浆DNA的EGFR基因具有插入、缺 失、替换或基因融合突变。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的高通量测序方法选自 Roche / 454FLX、Illumina / Hiseq / Miseq、Applied Biosys terns SOLID 和 life Technologies / Ion Torrent / Proton。
11. 一种无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，包括血浆DNA提取试剂、DNA 环化酶、目标DNA扩增引物及扩增试剂。
12. 根据权利要求11所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，进一步包 括EGFR基因待检测区域预扩增引物及预扩增试剂。
13. 根据权利要求11所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，进一步包 括用于高通量测序的试剂。
14. 根据权利要求13所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，其中所 述的用于高通量测序的试剂是用于如下高通量测序技术的：Roche / 454FLX、Illumina / Hiseq / Miseq、Applied Biosystems SOLID 和 life Technologies / Ion Torrent / Proton。
15. 根据权利要求11所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述EGFR 基因待检测区域扩增引物是一对相邻且背向延伸的引物对。
16. 根据权利要求15所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述背向 延伸的引物对中的引物均位于所述EGFR基因的待检位点或待检区域的5'端或3'端。
17. 根据权利要求15所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述背向 延伸的引物对之间间隔所述血浆DNA总碱基对的0-1 / 2。
18. 根据权利要求15所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述背向 延伸的引物针对EGFR基因外显子18、外显子19、外显子20或外显子21。
19. 根据权利要求17所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述背向 延伸的引物针对EGFR基因外显子18、外显子19、外显子20或外显子21，其引物序列分别 为： E18-1-3F ：CCCAGCTTGTGGAGCCTC E18-1-3R ：GACAAGAACACAGAGACAAGGGT E18-2-F ：GCAGGGCCTCTCATGGTC E18-2-R ：CCTGTGCCAGGGACCTTAC E19-1-F ：ACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCAT E19-1-R ：GTGAGATGGTGCCACATGCT E19-2-F ：GTCCATGGCTCTGAACCTCA E19-2-R ：CCACACAGCAAAGCAGAAAC E20-1-F ：CACACTGACGTGCCTCTCC E20-1-R ：CTTCGCATGGTGGCCAGA E20-2-1F ：CCTCCCCGTATCTCCCT E20-2-1R ：GGAGATAAGGAGCCAGGAT E21-1-F ：AGCAGGGTCTTCTCTGTTTCA E21-1-R ：GAGGGACAGATCATCATGGG E21-2-F ：TTTCCTGACACCAGGGACC E21-2-R ：TGACCTAAAGCCACCTCCTT〇
20. 根据权利要求11所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述血浆 DNA连接接头带有标签序列。
21. 根据权利要求11所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，在对所述 血浆DNA进行环化之前，进一步包括对所述血浆DNA进行预扩增的步骤。
22. 根据权利要求11所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述环化 采用的是夹板介导的单链DNA环化。
23. 根据权利要求11所述的无创检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述EGFR 基因的待检测位点或待检区域具有插入、缺失、替换或基因融合突变。
24. 针对EGFR基因外显子的引物在制备用于无创检测受试者中EGFR基因突变的诊断 试剂或试剂盒中的用途，其特征在于，所述诊断试剂或试剂盒适用于包括以下步骤的无创 检测受试者中EGFR基因突变的方法： 抽提受试者血浆DNA ; 将上述抽提的血浆DNA与标签接头连接； 将上述与标签接头连接的血浆DNA进行PCR预扩增； 将所述扩增后的DNA进行环化，得到环化DNA ; 利用所述引物对所述环化DNA进行PCR扩增；以及 对所述PCR扩增的产物进行高通量测序并分析EGFR基因的突变。
25. 根据权利要求24所述的用途，其特征在于，所述引物是一对相邻且背向延伸的引 物对。
26. 根据权利要求24所述的用途，其特征在于，所述背向延伸的引物对中的引物均位 于所述EGFR基因外显子的5'端或3'端。
27. 根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物对之间间隔所述 片断DNA总碱基对的0-1 / 2。
28. 根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外 显子18、外显子19、外显子20或外显子21。
29. 根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物5'含有用于高通 量测序文库的接头序列。
30. 根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物针对EGFR基因外 显子18、外显子19、外显子20或外显子21，其引物序列分别为： E18-1-3F ：CCCAGCTTGTGGAGCCTC E18-1-3R ：GACAAGAACACAGAGACAAGGGT E18-2-F ：GCAGGGCCTCTCATGGTC E18-2-R ：CCTGTGCCAGGGACCTTAC E19-1-F ：ACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCAT E19-1-R ：GTGAGATGGTGCCACATGCT E19-2-F ：GTCCATGGCTCTGAACCTCA E19-2-R ：CCACACAGCAAAGCAGAAAC E20-1-F ：CACACTGACGTGCCTCTCC E20-1-R ：CTTCGCATGGTGGCCAGA E20-2-1F ：CCTCCCCGTATCTCCCT E20-2-1R ：GGAGATAAGGAGCCAGGAT E21-1-F ：AGCAGGGTCTTCTCTGTTTCA E21-1-R ：GAGGGACAGATCATCATGGG E21-2-F ：TTTCCTGACACCAGGGACC E21-2-R ：TGACCTAAAGCCACCTCCTT〇
31. 根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述环化采用的是夹板介导的单链DNA 环化。
32. 根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述血浆DNA的EGFR基因具有插入、缺 失、替换或基因融合突变。
33. 根据权利要求24所述的方法，其特征在于，其中所述的高通量测序方法选自 Roche / 454FLX、Illumina / Hiseq / Miseq、Applied Biosystems SOLID 和 life Technologies / Ion Torrent / Proton。
【专利摘要】本发明涉及一种无创检测受试者中EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：针对EGFR基因外显子设计引物；抽提受试者血浆DNA；将上述抽提的血浆DNA与标签接头连接；将上述与标签接头连接的血浆DNA进行PCR预扩增；将所述扩增后的DNA进行环化，得到环化DNA；利用所述引物对所述环化DNA进行PCR扩增；以及对所述PCR扩增的产物进行高通量测序并分析EGFR基因的突变。本发明还涉及有关的试剂盒。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104745679
【申请号】CN201310756037
【发明人】王丽娜, 茹兰兰, 李天成, 张亚晰, 张建光, 高扬, 周代星
【申请人】北京贝瑞和康生物技术有限公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年12月31日
【公告号】WO2015101175A1