布封闭试管后 平置，传毒24h; 3. 5)胚芽鞘接毒后暗培养：将胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25°C条件下浸润了 40-60ymol/L的ABA溶液的吸水棉上暗培养； 4) 荧光定量PCR获得各水稻品种周期时间点的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达 量（RQ值）：灰飞虱传毒结束后4-10天内在每隔1. 5-2. 0天均匀分布的3-4个时间点采集 待测水稻和鉴定标尺胚芽鞘长度的正中间部位40-60g，每个品种每个取材时间点取材2-3 重复，-70°C保存，提取RNA并纯化，（RNA提取方法为：取适量叶片加液氮于研钵中迅速磨 碎，按比例加入TRI-Reagent到1. 5ml离心管中，样品体积不应超过TRI-Reagent体积10%， 4°C12000Xg低温离心1. 5min，然后小心转移上清到新的离心管中；RNA纯化方法为：a)直 接添加一体积（95%-100%)酒精到已经溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩涡混匀；b)转移 到吸附柱中过滤(吸附柱置于收集管中)，然后12000Xg离心lmin，之后把吸附柱转移到新 的收集管中；c)加400y1RNAWashBuffer到离心柱中，12000Xg离心lmin;d)将80y1 配好的DNAaseIcocktailbuffer直接加到离心柱中，25_37°C水浴加热离心柱15min， 12000Xg离心30s;e)添加400ylRNAPrewash到吸附柱中，12000Xg离心lmin，收集过滤 的液体，重复此步骤；f)添加700ylRNAWashBuffer到吸附柱中，12000Xg离心lmin，然 后从收集管中小心转移吸附柱到一个新的RNase-free1. 5ml离心管中；g)至少添加25y1 DNase/RNase-FreeWater到离心管基质中，最大速度离心lmin，被洗脱的RNA可以直接利 用或保存于-70 °C超低温冰箱中。）取1yL上述病毒RNA提取液，加入荧光定量PCR反应 体系，利用引物RBSDV-F:5'-AGAGCTCTTCTAGITAITGCG-3' 和RBSDV-R:5'-TCAGCA AAAGGTAAAGGAACG-3'按照荧光定量PCR扩增程序扩增RBSDV病毒S7片段，扩增完毕， 进入结果分析界面，以GAPDH为内参，与对照组相比，获得每个品种每个取样时间点重复的 RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达量（RQ值）； 5) 绘制RBSDV增殖指数趋势线：利用多重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒 后每个取样时间点的RQ值均值，以RQ值均值为纵坐标、饲毒后周期取样时间点为横坐标， 对数据进行统计分析，获得RBSDV增殖指数趋势线y=Aekx; 6)根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平 和抗性等级： 6. 1)待测品种抗性水平评价：根据每个品种RBSDV增殖指数趋势线公式y=Aekx评价待 测水稻品种的抗性水平，即公式中k值大的品种比k值小的品种对RBSDV抗性低； 6. 2)待测品种抗性等级划分：根据待测品种和鉴定标尺k值大小来评价待测品种的抗 性等级，即待测品种k值小于等于尚抗标尺为尚抗品种，待测品种k值大于尚抗标尺且小 于等于中抗标尺的为中抗品种，待测品种k值大于中抗标尺且小于等于感病标尺为感病品 种，待测品种k值大于感病标尺为超感品种。 实施例
[0024] 2015年，利用该发明的鉴定方法对征集得到的部分水稻品种资源进行了黑条矮缩 病抗性鉴定，具体步骤如下： 1) 选择鉴定标尺：根据室内接毒鉴定中抗病表现设置水稻黑条矮缩病鉴定标尺，分别 设置镇稻88、淮糯12、秀水04三个水稻品种做为高抗、中抗、感病鉴定标尺，其中，镇稻88 在2012-2014年室内接毒鉴定中抗病表现在152个淮北稻区水稻品种资源群体中排名12， 淮糯12排名30,秀水04排名76 ; 2) 低氧诱导待测水稻和鉴定标尺品种的胚芽鞘：每个品种取18粒种子，用0. 6%次氯酸 钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25°C条件下2. 0ymol/L的IAA 溶液液面下8cm处低氧诱导培养3天，诱导出胚芽鞘； 3) 胚芽鞘接种带毒灰飞虱后暗培养： 3.URBSDV毒源获取：2014年从江苏水稻黑条矮缩病重病区田间采集表现为水稻黑条 矮缩病症状的分蘖盛期水稻病株，-70°C保存； 3. 2)传毒介体继代繁殖：大田采集并纯化灰飞虱高龄若虫，用水稻幼苗武育粳3号饲 养并传代； 3. 3)介体饲毒：饲毒时从_70°C冰箱中取出水稻黑条矮缩病病株，常温放置3_5h使病 株自然展开，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋紧密包扎，确保水不会流出，然后将 其移入保鲜盒内，将室内人工饲养的二龄灰飞虱若虫转入保鲜盒内的RBSDV毒源水稻上， 25°C饲毒48h后移除毒源，将灰飞虱转移到武育粳3号秧苗上饲养25天度过循回期； 3. 4)胚芽鞘接种带毒灰飞虱：将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管中，每个 试管一个种子，按照6虫/个胚芽鞘的比例定量接种带毒灰飞虱，用透气纱布封闭试管后平 置，传毒24h; 3. 5)胚芽鞘接毒后暗培养：将胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25°C条件下浸润了 50ymol/L的ABA溶液的吸水棉上暗培养； 4) 荧光定量PCR获得各水稻品种周期时间点的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表 达量（RQ值）：灰飞虱传毒结束后4-10天内每隔2天采集待测水稻和鉴定标尺胚芽鞘的正 中间长度部位约50g，每个品种每个时间点3重复，-70°C保存，然后提取RNA并纯化，（RNA 提取方法为：取适量叶片加液氮于研钵中迅速磨碎，按比例加入TRI-Reagent到1. 5ml离 心管中，样品体积不应超过TRI-Reagent体积10%，4°C12000Xg低温离心1. 5min，然后小 心转移上清到新的离心管中；RNA纯化方法为：a)直接添加一体积（95%-100%)酒精到已经 溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩涡混匀；b)转移到吸附柱中过滤（吸附柱置于收集管 中），然后12000Xg离心lmin，之后把吸附柱转移到新的收集管中；c)加400y1RNAWash Buffer到离心柱中，12000Xg离心lmin;d)将 80yl配好的DNAaseIcocktailbuffer 直接加到离心柱中，25-37°C水浴加热离心柱15min，12000Xg离心30s;e)添加400y1RNA Prewash到吸附柱中，12000Xg离心lmin，收集过滤的液体，重复此步骤；f)添加700yl RNAWashBuffer到吸附柱中，12000Xg离心lmin，然后从收集管中小心转移吸附柱到一 个新的RNase-free1.5ml离心管中；g)至少添加 25ylDNase/RNase-FreeWater到离心 管基质中，最大速度离心lmin，被洗脱的RNA可以直接利用或保存于-70°C超低温冰箱中。） 然后荧光定量PCR，扩增完毕，进入结果分析界面，以GAPDH为内参，与对照组相比，获得每 个品种每个取样时间点重复的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达量（RQ值）； 5) 绘制RBSDV增殖指数趋势线： 5. 1)计算待测水稻和鉴定标尺饲毒后每个取样时间点的RQ值均值：利用3重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒后每个取样时间点的RQ值均值，鉴定标尺RQ均值统 计结果如下表；
【主权项】
1. 一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法，其特征在于：该鉴定方法包括以下步 骤： 1) 选择鉴定标尺：根据人工接毒鉴定中不同品种对水稻黑条矮缩病抗性表现设置高 抗、中抗、感病三个鉴定标尺，选择三个相应水稻品种做为鉴定标尺；