检测ApoE基因多态性的引物、试剂盒及其PCR方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了检测ApoE基因多态性的引物、 试剂盒及其PCR方法，用于ApoE基因 rs429358和rs7412两个多态位点的快速检测。
【背景技术】
[0002] ApoE基因与多种心脑血管疾病密切相关，其编码的载脂蛋白E (Apolipoprotein E，ApoE)参与高血脂症、动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病的整个发生发展过程，ApoE 基因多态性是这些疾病早期及发展过程中个体差异的主要原因。
[0003] ApoE的氨基酸序列的112位和158位两种氨基酸残基即精氨酸（Arg)和半胱 氨酸（Cys)的交换决定了异构体的种类。ApoE基因有3种异构体，分别为ApoE2、ApoE3 和ApoE4,其中ApoE3在中国人群中分布比较广泛，所占比例约为60%~70%，也可称为正常基 因。每一个等位基因对应于一个主要异构体产生三种纯合子（E2/E2, E3/E3, E4/E4)和三 种杂合子（E2/E3，E2/E4，E3/E4)共六种常见表型。ApoE基因具有异构体特异性，即不同基 因编码的蛋白质功能具有差异性，从而导致不同蛋白质对脂质的代谢能力不同、抗氧化及 抗炎症能力不同。
[0004] ApoE基因多态性是冠心病（CHD)早期及发展过程中个体差异的主要原因，通过 ApoE基因多态性的检测可以了解个体CHD及心肌梗塞（MI)的易感性。Ap〇E2的作用是降 低胆固醇浓度，对冠状动脉硬化的发展有一定的防护作用，而ApoE 4则会使血浆LDL-C、TC 浓度升高，易诱发CHD及MI。
[0005] 另外国内外多项研宄发现，ApoE基因是目前已知的阿尔茨海默病最密切的遗传标 志物，Ap 〇E4携带者阿尔茨海默病的易感性增加。
[0006] 目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法； PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP ;PCR高分辨熔解曲线分析技 术；PCR-Taqman MGB (Minor Groove Binder)探针法；AS-PCR 法；Cast-PCR 法等。这些方 法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床 普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。
[0007] 如：1)直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测 基因突变的灵敏度为20%(即目的基因的突变基因 DNA模板数占野生型DNA模板数的20%)。 同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大 增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易 实施等缺点。
[0008] 2)普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP 仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致 假阳性的风险，见[Mol Diagn Ther. 2010 Jun 1; 14(3) :163-9, United States Patent 20120135406]。
[0009] 3)芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用 于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。
[0010] 4) PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低， 但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高 昂，普及受限，见[Clin Chim ACqa. 2012 Nov 12;413(21-22):1781-5; United States Patent 20110045479]〇
[0011] 5) PCR-Taqman MGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见[J Clin Microbiol. 2010 Aug;48(8) :2909-15 ;United States Patent 20090311679]，并且不能检测样本中的含量 较少（彡1，〇〇〇个中的1个）的等位基因或突变位点。
[0012] 6)PCR_SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染， 而且操作步骤多，费时费力。
[0013] 7)等位基因特异性引物PCR扩增法（AS-PCR)，这一方法是目前检测基因突变或 SNP最简单快速的方法（Wu D Y, Ugozzoli L, Pal B K, Wallace R B·，Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端碱基与模板的碱基错配，其PCR的 效率将会下降 IO3-IO6.6倍（Chen, X·，and Sullivan, P F, The Pharmacogeonomics Journal 2003，3，77-96)。尽管该方法的原理简单，但错配的引物，依然会发生非特异 性扩增，扩增情况视突变的类型和检测位点周围的碱基序列相关（Ayyadevara S, Thaden J J, Shmookler Reis R J·, Anal Biochem 2000; 284:11-18)，还与样本中存在的等位 基因变量的影响。为了增加 AS-PCR的特异性，许多科学家做了很多努力。大量的实验证 明，该方法最关键的是设计与3'末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设 计不好，将导致高背景的交叉扩增，会导致较高的假阳性。尽管不少人努力将这一弊端克 月艮，如报道的TaqMAMA方法，在3'倒数第二位或第三位上引入突变碱基，的确可以增加 反应的特异性，但仍然无法完全消除假阳性，而且在纯合子与杂合子的判断上，缺乏标准， 会出现混乱的情况，见[J Virol Methods. 2008 Nov;153(2):156-62;Genomics. 2004 Feb; 83 (2) :311-20]。简单的AS-PCR，通常采用PCR反应结束后再进行电泳，从有无反应 条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了 PCR的污染机会， 而且耗时费力。尽管有人对该方法作了改进，采用荧光定量PCR技术，但得到的不是"全或 无"式的结果，总会有非特异性反应的发生，即同样的引物对野生型和突变型位点都会扩 增，只是其得到的Ct (Cycle threshold)不同而已，因此就引入了 ACt的概念，即ACt= 野生Ct-突变Ct，但计算复杂，如要Λ Ct值大于纯合子Ct值判为突变型纯合子，Λ Ct值 小于杂合子Ct值，判为杂合子，ACt值的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为 ACt值的设定标准无法准确定位，不同人员的操作、不同的标本和不同的检测仪器都会有 不同的数字，给临床应用带来很大的困难，实际应用依然受限，见[中国专利CN101235415， CN101565742A]〇
[0014] 8)美国LIFE公司采用一种MGB封闭探针的方法，称作Cast-PCR ( Competitive allele specific Taqman PCR)，用MGB探针将不检测的位点封闭，然后用等位基因特异 引物荧光定量PCR的方法检测目的位点，这虽然提高了检测的特异性，但由于多加入一 条MGB封闭探针，势必增加成本，对反应效率多少会带来干扰，见[Exp Mol Pathol. 2012 Jun; 92 (3) :275-80; United States Patent 20100221717 ;CN102428190A]。有人采用锁 核酸（LNA) ( Plant Method 2007, 3 :2)或修饰的碱基（Anal Biochem. 2005, 340 :287-294) 的PCR引物，可以使得AS-PCR检测灵敏度提高。然而，这些方法增加了分析的总体成本，并 需对反应进行深度优化。
[0015] 目前，国内已上市有注册证的ApoE基因检测试剂盒有如下几种：1、广州科方生物 技术有限公司的"载脂蛋白E (ApoE)测定试剂盒（免疫比浊法）"，粵食药监械（准）字2014 第2400852号；2、北京利德曼生化股份有限公司的"载脂蛋白E测定试剂盒-ΑΡ0Ε(免疫比 浊法）"京食药监械（准）字2012第2400826号；3、北京恩济和生物科技有限公司的"载 脂蛋白E(ApoE)测定试剂盒（免疫比浊法）"，京食药监械（准）字2013第2401277号；4、 长春汇力生物技术有限公司的"载脂蛋白E(ApoE)测定试剂盒（免疫比浊法）"，吉食药监 械（准）字2014第2400070号等共9种产品，均是免疫学方法。
[0016] 免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法，通过测定反应液的浊度与一系列标准 品对照，即可计算出检样中抗原的含量。操作过程受很多因素的限制，如抗原或抗体量太大 过剩，可出现可溶性复合物，造成误差；必须维持反应管中抗体蛋白始终过剩；易受到脂血 的影响。免疫比浊法分为三类：免疫透射比浊法；免疫散射比浊法和免疫胶乳比浊法。对实 验操作条件均有较多的要求，且结果判断繁琐。
[0017] 目前从基因水平检测ApoE多态性的方法大致有以下几种，反向斑点杂交、基因芯 片、Taqman-MGB双探针法及直接测序等方法。中国专利CNl786188A报道了用反向斑点杂交 方法检测ApoE基因型的方法，该法存在操作复杂，周期长，以及分析速度慢，容易发生PCR 产物的污染出现假阳性等缺点。中国专利CN 102010897 A公开了一种用液相基因芯片检测 ApoE多态性的方法，芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特 点，适用于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵，同样 也存在操作复杂，周期长，以及分析速度慢，容易发生PCR产物的污染出现假阳性等缺点。 中国专利CN101608229A公开了一种用Taqman-MGB双探针荧光PCR的方法，检测ApoE基因 型，该法常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见 [J Clin Microbiol. 2010 Aug;48(8):2909-15 ；United States Patent 20090311679], 并且不能检测样本中的含量较少（多1，〇〇〇个中的I个）的等位基因或突变位点。中国专 利CN 102676669 A采用焦磷酸测序法检测ApoE基因多态性，直接测序法是目前鉴定基因 型别的金标准方法，能发现已知和未知突变位点，但该方法需要昂贵的仪器，每个位点均需 PCR扩增，然后测序，操作复杂，成本较高、工作量大、周期长、在基层不易实行。
[0018] 因此，如何解决检测ApoE基因多态性存在的问题，成为人们亟待解决的问题。
【发明内容】
[0019] 鉴于此，本发明提供了一种检测ApoE基因多态性的引物、试剂盒及其PCR方法， 以至少解决以往试剂盒存在的结果判读复杂、检测仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴 性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等一个或多个问 题。
[0020] 本发明提供的方案具体为：一种检测ApoE基因多态性的引物，其特征在于，所述 引物包括分别检测rs42