9358位点和rs7412位点的两组引物； 第一组引物： rs429358位点的突变型特异性上游引物、rs429358位点的野生型特异性上游引物和 rs429358位点的突变型特异性上游引物与野生型特异性上游引物共用的第一下游引物，且 所述rs429358位点的突变型特异性上游引物具有SEQ No. 21序列，所述rs429358位点的 野生型特异性上游引物具有SEQ No. 24序列，所述共用的第一下游引物具有SEQ No. 23序 列； 第二组引物： rs7412位点的突变型特异性上游引物、rs7412位点的野生型特异性上游引物和 rs7412位点的突变型特异性上游引物与野生型特异性上游引物共用的第二下游引物，且所 述rs7412位点的突变型特异性上游引物具有SEQ No. 29序列，所述rs7412位点的野生型 特异性上游引物具有SEQ No. 32序列，所述共用的第二下游引物具有SEQ No. 30序列。
[0021] 本发明一方面还提供了一种检测ApoE基因多态性的试剂，其特征在于：所述试剂 含有上述的引物。
[0022] 本发明另一方面还提供了一种检测ApoE基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述 试剂盒含有上述的引物。
[0023] 优选，所述试剂盒还包括分别与上述第一组引物和第二组引物配合使用的第一探 针和第二探针，且所述第一探针和第二探针均为Taqman探针，其中，所述第一探针具有SEQ No. 22序列，所述第二探针具有SEQ No. 31序列。
[0024] 进一步优选，所述试剂盒还包括PCR反应管、dNTPs和Taq酶混合液、PCR缓冲液、 检测管家基因 GAPDH的上游引物、检测管家基因 GAPDH的下游引物、检测管家基因 GAPDH的 探针、阳性质控品和空白对照； 所述检测管家基因 GAPDH的上游引物具有SEQ No. 26序列；所述检测管家基因 GAPDH 的下游引物具有SEQ No. 27序列；所述检测管家基因 GAPDH的探针具有SEQ No. 28序列。
[0025] 进一步优选，所述rs429358位点的突变型特异性上游引物、所述共用的第一下游 引物、所述第一探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的 下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针被预先包被于第一 C型PCR反应管内；所述 rs429358位点的野生型特异性上游引物、所述共用的第一下游引物、所述第一探针、所述检 测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针被预先包被于第一 T型PCR反应管内；所述rs7412位点的突变型特异性上游 引物、所述共用的第二下游引物、所述第二探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所 述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针被预先包被于第二T 型PCR反应管内；所述rs7412位点的野生型特异性上游引物、所述共用的第二下游引物、所 述第二探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和 所述检测管家基因 GAPDH的探针被预先包被于第二C型PCR反应管内。
[0026] 进一步优选，所述第一 C型PCR反应管内rs429358位点的突变型特异性上游引 物、所述共用的第一下游引物、所述第一探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述 检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、 50nM-2uM、50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、0. 05pm-5pm ;所述第一 T 型 PCR 反应管内 rs429358位点的野生型特异性上游引物、所述共用的第一下游引物、所述第一探针、所述 检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家 基因 GAPDH 的探针浓度分别为 50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、 0. 05pm-5pm ;所述第二T型PCR反应管内rs7412位点的突变型特异性上游引物、所述共 用的第二下游引物、所述第二探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基 因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、 50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、0. 05pm-5pm ;以及所述第二 C 型 PCR 反应管内 rs7412 位 点的野生型特异性上游引物、所述共用的第二下游引物、所述第二探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针 浓度分别为 50nM-2um、50nM-2uM、50nM_400nM、lpm_20pm、lpm-20pm、0. 05pm_5pm。
[0027] 进一步优选，所述第一 C型PCR反应管内rs429358位点的突变型特异性上游引 物、所述共用的第一下游引物、所述第一探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述 检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为500nM、 500nM、100nM、5pm、5pm、2. 5pm ;所述第一 T型PCR反应管内rs429358位点的野生型特异 性上游引物、所述共用的第一下游引物、所述第一探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引 物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为 500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2. 5pm ;所述第二T型PCR反应管内rs7412位点的突变型特 异性上游引物、所述共用的第二下游引物、所述第二探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游 引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为 500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2. 5pm ;以及所述第二C型PCR反应管内rs7412位点的野生 型特异性上游引物、所述共用的第二下游引物、所述第二探针、所述检测管家基因 GAPDH的 上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分 别为 500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2. 5pm。
[0028] 本发明还提供了一种上述引物或上述试剂盒的PCR方法，其特征在于：PCR反应按 两步扩增循环程序进行，且第一步扩增的循环数小于第二步扩增的循环数，所述第一步扩 增的退火温度高于所述第二步扩增的退火温度。
[0029] 优选，所述PCR反应的条件为：37°C 2min，95°C 2min预变性；第一步扩增，95°C 变性 5s，55°C~68°C 退火 32s，循环 10~15 次；第二步，95°C 变性 5s，50°C~65°C 退火、 延伸32s，循环30~50次，收集荧光信号；进一步优选，所述PCR反应的条件为：37°C 2min， 95°C 2min预变性；第一步扩增，95°C变性5s，63°C退火32s，循环15次；第二步，95°C 变性5s，60°C退火、延伸32s，循环40次，收集荧光信号。
[0030] 本发明提供的检测ApoE基因多态性的引物及其试剂盒，能够大大增加等位基因 特异性引物PCR区分不同等位基因位点的能力，使不同位点间的非特异性交叉扩增的可能 性降到最低，能够做到真正"全或无"式的扩增，不仅有很好的特异性，也具有非常好的灵敏 度，能检出Ing基因组DNA中的基因型分布情况。
[0031] 本发明提供的检测ApoE基因多态性的引物及其试剂盒，具有以下优点： 1)通过对引物序列上的人为改变使检测结果真正做到对结果"全或无"判断，大大简化 了结果判读的难度，降低了出错的可能，为科研和临床应用提供了便利。
[0032] 2) T aq酶与dNTPs的混合，保障了 dNTPs的稳定性，使其可经受多次反复冻融的 考验。
[0033] 3)提前预配好可直接使用的缓冲液，使用者更加方便。
[0034] 4)引物和探针提前包被在PCR反应管内，避免了操作者出现位点配错的可能，而 且也节约了大量操作时间。
[0035] 5)本发明中引物和试剂盒具有特异性好，检测的灵敏度高，检测速度快，整个过程 能在1小时20分钟内完成。
[0036] 6)试剂盒内仅用一条常规Taqman探针，别无其他诸如封闭探针，降低成本。
[0037] 7)该试剂盒具有检测简单、快速、准确、价廉等优点。
【附图说明】
[0038] 图1为不同突变型特异性引物产生的扩增信号图； 图2为E2/E2型ApoE基因的扩增曲线图； 图3为E2/E3型ApoE基因的扩增曲线图； 图4为E2/E4型ApoE基因的扩增曲线图； 图5为E3/E3型ApoE基因的扩增曲线图； 图6为E3/E4型ApoE基因的扩增曲线图； 图7为E4/E4型ApoE基因的扩增曲线图； 图8为管家基因 GAPDH的PCR扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0039] 下面以具体的案例对本发明进行进一步解释，但并不用于限制本发明的保护范 围。
[0040] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用产品均为市购。
[0041] 以下定义是本发明中相关术语的解释： "等位基因"一般是指DNA区段，同源染色体上的相同物理位置上，控制相对性状的一 对基因。在一些情况下，等位基因可以对应于特定物理基因座上的单核苷酸的替换。在其 它情况中，等位基因可以对应于核苷酸（单个或多个）插入或缺失。
[0042] "等位基因特异性引物"是指与目标等位基因的序列互补，在PCR时能够延伸完成 特异的PCR反应。等位基因特异性引物可以设计成能检测出靶序列中少至1个核苷酸差异 十分特异的引物，该引物可以包含等位基因特异性核苷酸部分、3'端靶标特异性部分和尾 巴。
[0043] "MGB基团"是指小沟结合剂。当与寡核苷酸的3'末端缀合时，MGB基团能够作为 不可延伸的封闭部分发挥作用。MGB是能结合于双链DNA的小沟内的分子，通常采用DPI3 (其合成方法参见美国专利号6, 084, 102 ;和6, 727, 356)。
[0044] "检测探针"是指：指示扩增的多种信号传导分子中的任意一种。例如，SYBR Green 和其它DNA结合染料都是检测探针。一些检测探针可以是序列特异性的，例如Taqman探 针（美国专利号5, 538, 848)，多种茎环分子信标（美国专利号6, 103, 476和5, 925, 517 以及 Tyagi and Kramer，Nature Biotechnology，1996,14:303-308)，无莖的或线性信标 (W099/21881)，PM Molecular Beacons TM(美国专利号 6, 355, 421 和 6, 593, 091)，线性 PNA 信标（Kubista 等人，2001，SPIE4264 :53-58)，非-FRET 探针（美国专利号 6, 150,097)， Sunrise/Amplifluor探针（美国专利号6, 548, 250)，莖环和双链Scorpion TM探针 (Solinas 等人，2001，NucleicAcidsResear