ch29 :E96 和美国专利号 6, 589, 743)，鼓起的 环探针（美国专利号6, 590, 091)，假结探针（美国专利号6, 589, 250)，cycliC〇n(美国专 利号 6,383, 752)，MGB Eclipse TM 探针（Epoch Biosciences)，发夹探针（美国专利号 6, 596, 490)，肽核酸（PNA)探针。检测探针可以包含焚光报告分子，例如，6-羧基焚光素 (6-FAM)或四氯荧光素（TET)，和淬灭分子部分，例如四甲基若丹明（TAMRA)，Black Hole QuencheRS (Biosearch)，Iowa Black (IDT)，QSY 猝灭剂（Molecular Probes)和 Dabsyl 和 Dabcel磺酸盐/羧酸盐猝灭剂（Epoch)。
[0045] "共用特异性引物"是指在PCR反应中与等位基因特异性引物配对的引物，它能同 不同位点的等位基因特异性引物配对使用。
[0046] "热稳定性的聚合酶"是指对热稳定性的或热抗性的酶，主要指DNA聚合酶，该酶在 PCR扩增时，在升高的温度条件下不会发生失活。
[0047] 寡核苷酸的"Tm"或"熔解温度"是指一段DNA中50%的分子与互补序列杂交时的 温度。Tm值可以使用熟知的公式来计算（见，Maniatis，T.等人：Molecular cloning，Cold Spring Harbor, N. Y. :1982)〇
[0048] "灵敏性"是指能够被检出模板的最小量（拷贝数）。
[0049] "特异性"是指区分匹配模板和错配模板的能力。特异性经常表示为Λ Ct = Ct错 配-Ct匹配。
[0050] "选择性"是指AS-PCR测定可用于测定混合物中的少数（通常是突变）等位基因 而无来自多数（经常是野生型）等位基因的干扰的程度。选择性经常表示为比例或百分率。 例如，能够在存在100个野生型模板的情况下检出1个突变模板的测定被称作具有1 : 100 或1%的选择性。
[0051] "Ct值"是指循环阈值，代表PCR扩增曲线由基线变为指数增长拐点时的循环数。
[0052] "德尔塔Ct"或"ACt"是指信号通过固定阈值时，两个不同样品或反应之间的循 环数差异。ACt是达到指数扩增时，两个不同样品或反应之间的循环数差异。ACt可用于 鉴定匹配引物与错配引物之间的特异性。
[0053] 本发明涉及快速检测ApoE基因多态性的引物和试剂盒。具体地讲，本发明是基 于 Past-PCR (Perfect allele-specific Taqman PCR)方法的基础上，成功应用于 ApoE 基 因 rs429358位点和rs7412位点的检测。所谓Past-PCR是由检测基因 SNP或突变的高特 异性AS-PCR方法和Taqman探针的焚光PCR技术结合而成，其每个位点仅用一条Taqman探 针，在多数的情况下，这条探针为常规的Taqman探针，仅在部分基因中因富含AT碱基的特 殊序列，采用Taqman-MGB或LNA等探针，除此之外无需任何额外的封闭探针或报告探针， Past-PCR方法将AS-PCR和Taqman荧光PCR两种方法完美结合，并使两者的优点得到了极 度的发挥，具体表现在AS-PCR方法中，在不增加任何成本的情况下，靠引物设计和独特的 验证方法成功消除了非特异性扩增，使得结果判断呈现出"全和无"方式，即有就有，没有就 没有，使得结果的判断简单而准确，这是对过去的AS-PCR方法最大的改进，也是对AS-PCR 方法为人所诟病的有效弥补，从而将AS-PCR方法的优点发挥到了极致，是该方法所能达到 的最高境界。众所周知，Taqman荧光PCR具有密闭性检测的特点，无需反应完结后的处理， 不仅节省了时间，而且减少了 PCR产物污染的风险，探针的第二次识别靶序列保障了检测 的特异性和可靠性，还可用于对基因的定量检测，达到了临床使用标准等优点。Past-PCR 方法具有AS-PCR方法和Taqman荧光PCR方法的双重优点，并且是这两种方法结合在一起 时，检测组份所能达到的最简化构成，因此，我们将其称作为完美的等位基因特异性Taqman PCR 0
[0054] 基于Past-PCR方法，发明了用于检测ApoE基因多态性的试剂盒，其基本组成为： (a)高度特异的等位基因特异性引物；(b)荧光检测探针；（c)与等位基因特异性引物配对 的另一条特异性引物。
[0055] 其中，本发明提供的一种检测ApoE基因多态性的引物，包括分别检测rs429358位 点和rs7412位点的两组引物； 第一组引物： rs429358位点的突变型特异性上游引物、rs429358位点的野生型特异性上游引物和 rs429358位点的突变型特异性上游引物与野生型特异性上游引物共用的第一下游引物，且 所述rs429358位点的突变型特异性上游引物具有SEQ No. 21序列，所述rs429358位点的 野生型特异性上游引物具有SEQ No. 24序列，所述共用的第一下游引物具有SEQ No. 23序 列； 第二组引物： rs7412位点的突变型特异性上游引物、rs7412位点的野生型特异性上游引物和 rs7412位点的突变型特异性上游引物与野生型特异性上游引物共用的第二下游引物，且所 述rs7412位点的突变型特异性上游引物具有SEQ No. 29序列，所述rs7412位点的野生型 特异性上游引物具有SEQ No. 32序列，所述共用的第二下游引物具有SEQ No. 30序列。
[0056] 同时还提供了含有上述引物的检测试剂和试剂盒，以至少解决以往试剂盒存在的 结果判读复杂、检测仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床 普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等问题，实现了检测简单、快速、准确、廉价的理 想要求，为科研和临床基因型和基因突变分析提供了强有力的工具。
[0057] 优选，所述试剂盒还包括分别与上述第一组引物和第二组引物配合使用的第一 探针和第二探针，且所述第一探针和第二探针均为Taqman探针，其中，所述第一探针具有 SEQ No. 22序列，所述第二探针具有SEQ No. 31序列，整个试剂盒每个反应管中仅使用一条 Taqman探针，别无其他诸如封闭探针等，降低试剂盒的成本。
[0058] 进一步优选，所述试剂盒还包括PCR反应管、dNTPs和Taq酶混合液、PCR缓冲液、 检测管家基因 GAPDH的上游引物、检测管家基因 GAPDH的下游引物、检测管家基因 GAPDH的 探针、阳性质控品和空白对照； 所述检测管家基因 GAPDH的上游引物具有SEQ No. 26序列；所述检测管家基因 GAPDH 的下游引物具有SEQ No. 27序列；所述检测管家基因 GAPDH的探针具有SEQ No. 28序列；其 中，将dNTPs和Taq酶混合，能够保障dNTPs的稳定性，使其可经受多次反复冻融的考验；检 测管家基因 GAPDH的上游引物、下游引物和探针是用于作为内参照，为防止检测时出现假 阴性；阳性质控品为CT型人基因组DNA ;空白对照为灭菌超纯水。
[0059] 进一步优选，所述rs429358位点的突变型特异性上游引物、所述共用的第一下游 引物、所述第一探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的 下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针被预先包被于第一 C型PCR反应管内；所述 rs429358位点的野生型特异性上游引物、所述共用的第一下游引物、所述第一探针、所述检 测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针被预先包被于第一 T型PCR反应管内；所述rs7412位点的突变型特异性上游 引物、所述共用的第二下游引物、所述第二探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所 述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针被预先包被于第二T 型PCR反应管内；所述rs7412位点的野生型特异性上游引物、所述共用的第二下游引物、所 述第二探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和 所述检测管家基因 GAPDH的探针被预先包被于第二C型PCR反应管内，按最佳的反应用量 预先包被在PCR反应管中，每一个反应管中实际包被六条寡核甘酸，即一条针对等位基因 的一种特异性上游引物，一条探针(通常为Taqman探针)、一条共用特异性下游引物、一条检 测管家基因 GAPDH的上游引物、一条检测管家基因 GAPDH的下游引物和一条检测管家基因 GAPDH的探针，这样为了检测一个位点不同的基因多态性，每个位点常需要分别包被两管或 两管以上的PCR反应管，它们中探针、共用特异性下游引物、检测管家基因 GAPDH的上游引 物、检测管家基因 GAPDH的下游引物和检测管家基因 GAPDH的探针是一样的，不同的仅是 鉴定等位基因不同型别的特异性上游引物，这样预先包被避免了操作者出现位点配错的可 能，而且节约了大量操作时间。
[0060] 进一步优选，所述第一 C型PCR反应管内rs429358位点的突变型特异性上游引 物、所述共用的第一下游引物、所述第一探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述 检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、 50nM-2uM、50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、0. 05pm-5pm ;所述第一 T 型 PCR 反应管内 rs429358位点的野生型特异性上游引物、所述共用的第一下游引物、所述第一探针、所述 检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家 基因 GAPDH 的探针浓度分别为 50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、 0. 05pm-5pm ;所述第二T型PCR反应管内rs7412位点的突变型特异性上游引物、所述共 用的第二下游引物、所述第二探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基 因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、 50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、0. 05pm-5pm ;以及所述第二 C 型 PCR 反应管内 rs7412 位 点的野生型特异性上游引物、所述共用的第二下游引物、所述第二探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探 针浓度分别为 50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、0. 05pm-5pm ;最为优 选，所述第一 C型PCR反应管内rs429358位点的突变型特异性上游引物、所述共用的第一 下游引物、所述第一探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH 的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、 2. 5pm ;所述第一 T型PCR反应管内rs429358位点的野生型特异性上游引物、所述共用的 第一下游引物、所述第一探针、所述检测管家基因 GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因 GAPDH的探针浓度分别为500nM、500