49] 通过将分离的人血清与兔补体、分化的HL-60细胞和金黄色葡萄球菌（MN8m株） 结合，并于37°C伴随颠倒混匀（tumbling)温育90分钟，以进行调理吞噬杀死测定。温育 后，在水浴超声发生器（Fisher Scientific, #FB15050)中对管子超声处理5分钟，100倍 稀释于含 〇· 05% Tween80 的 TSB 中，并用螺旋接种仪（spiral plater) (IUL, Ensemmenseur Spiral Easy Jet)对数地涂板（plated)在TSA平板上。通过将每个平板上出现的集落 数定量来确定血清PNAG抗体滴度。在测定中，通过在37°C TSB+2% NaCl中以240rpm摇 菌生长16小时来制备金黄色葡萄球菌（MN8m株）。当细菌培养物达到约0D_0. 4时，细菌 被200x稀释在HBSS/0. 1%明胶中。在4°C将幼兔补体（#31061批次#21832L，PelFreez Biologicals)预先吸附在蛋白G琼脂糖上（Sigma # P3296-5ML)1小时。使用前，允许HL-60 细胞在1?^11640/10%?85/611^311^111/0.8%01^中于4110 5细胞/1111的细胞浓度分化 3-4 天。
[0150] 通过将分离的人血清与兔补体、分化的HL-60细胞和荧光标记的金黄色葡萄球菌 (MN8m株）结合，并在37°C伴随旋转温育30分钟，来进行调理吞噬测定。血清PNAG抗体滴 度通过用FACS机器将被HL60细胞吞噬的细菌量定量来确定。在测定中，使用了 5, 6羧基荧 光素琥珀酰亚胺酯标记的MN8株（分子探针（Molecular Probes) #01311)。分化的HL60 细胞在缓冲液中预洗涤两次（第二次洗涤步骤进行至少20分钟）并在测定缓冲液中稀释 至2. 5xl04细胞/40 μ 1的浓度。
[0151] 表4和图3、4和5中所示结果显示F598展示出长末端消除半衰期（~20-30天）， 0. 0699至0. 0851mL/h/kg的低全身清除和53. 4至67. 0mL/kg的低表观分布体积（apparent volume of distribution)。观察到了调理吞活性的剂量依赖性增加。对每个剂量，这种 活性从剂量后第一时间点（4h)开始达到最高，并不随时间降低（直到第50天）。
[0152] 表4. F589在人受试者中的药代动力学
[0153]
[0154] 实施例6. F598的2a期研宄
[0155] A)研宄设计
[0156] 进行了一项随机、双盲、安慰剂对照的2a期研宄，以评估重症监护室中并进行机 械通风（mechanical ventilation)的住院患者中单静脉内剂量的F598的药代动力学、药 效学和安全性。六名患者在这项研宄中接受治疗。如果受试者在重症监护室中住院且在进 行机械通风，那么他/她符合参与研宄的资格。
[0157] 将F598配制为浓度17. Omg/mL的液体。两个剂量方案的药物都在250mL的生理 盐水（0· 9% NaCl)中通过静脉输注施用历时2小时。以8. 6mg/kg或12. 9mg/kg给予患者 单剂量的药物。
[0158] 安慰剂是盐水溶液（0. 9% NaCl)，其以250mL通过静脉输注施用历时2小时。
[0159] 总计观察患者91天。在给药前1天筛选患者，在第1天给予其一次静脉内注射 F598,在90天内随访。
[0160] 使用非分割（non-compartmental)方法来计算F598的如下药代动力学（PK)参 数：输注结束时的血清浓度（C eJ、从0时间到实时tlast的血清浓度对时间曲线下的面积、 最后一次测量血清浓度的时间（t last)、外推至无限（extrapolated to infinity)的血清浓 度对时间曲线下的面积（AUC)、终末半衰期（t1/2z)、来自血清的药物的全身清除率（CL)、和 在稳定状态分布的体积（V ss)。
[0161] 如下是功效/药效学终点。没有主要终点。次要终点为：药效学：随时间的调理素 滴度；免疫原性：人抗人抗体（HAHA);探索性的功效（exploratory efficacy):直到第28 天的由PNAG表达病原体引起的有记录的感染；和探索性功效：机械通风的持续期，ICU住 院，住院，28天和90天全因死亡率。
[0162] 安全性终点为：急性输液反应、直到第90天的治疗突发的不良事件 (treatment-emergent adverse events, TEAE)和标准血液学和血液化学，以及血液培养和 气管内吸入（endotracheal aspirates, ETA)培养（对于在进行机械通风的患者）。
[0163] 药代动力学/药效学采样时间和生物分析方法如下：
[0164] · PK :
[0165] -采样时间：第1天在给药前（predose)、1、2小时（输注结束）和8小时收集血 样，然后在给药后（postdose)第2、5、7、14、21、28、56、70和90天收集。
[0166] -生物分析方法：通过已验证的定量下限为0. 0858 μ g/mL的酶联免疫吸附测定 (ELISA)来确定F598的血清浓度。
[0167] ?人抗 F598 抗体（HAHA):
[0168] -采样时间：在给药前收集血样，然后在给药后第14、28、56和90天收集。
[0169] -生物分析方法：通过已验证的电化学发光（ECL)免疫测定检测血清HAHA。
[0170] · PD :
[0171] -采样时间：调理吞噬测定（OPA):第1天：给药前、2小时（输注结束）、第2、7、 14、28、56、90天；杀死测定（OPK)采样：第1天：给药前、2小时（输注结束）、第14天、第28 天、第90天。
[0172] -生物分析方法OPA :基质（Matrix):血清/分析技术：0ΡΑ/定量下限：NA/测定体 积：NA/生物分析的位点：Flowapps/参考的方法：FA-440。
[0173] -生物分析方法OPK :基质：血清/分析技术：0ΡΑ/定量下限：NA/测定体积：NA/生 物分析的位点：Fl〇Wapps/参考的方法：FA-445。
[0174] 统计学方法如下。主要的分析是用描述性统计学根据剂量对PK变量（Ce()i，AUC last、 AUC、CL、Vss、t1/2JPtlast)的总结。分析是基于由所有具有至少一个可评估PK数据点的随 机患者组成的PK群体。安全性群体定义为所有被随机化并通过输注来施用研宄药物（不 管输注是否完成）的患者。安全性数据是通过实际接受的治疗或剂量来总结的。不良事件 发生率表格是通过实际接受的治疗或剂量、系统-器官-类别（system-organ-class，S0C) 和优选术语（preferred term, PT)来呈现的。
[0175] B)结果
[0176] 所述2a期研宄的结果如下。6名患者接受F598输注；2人接受安慰剂，2人接受 8. 6mg/kg F598,以及2人接受12. 9mg/kg F598。只考虑被施用了 F598输注的患者的PA、 安全性和其他探索性评估。
[0177] 单IV剂量后的F598PK参数总结在如下表5中。
[0178] 表5. F598药代动力学参数的个体值
[0179]
[0180] a范围；不收集超过对应于t last的时间点的PK样品，但计划收集它们直到第90天 (T2160h)；
[0181] b不计算，由于在一个受试者中输注结束时没有采样
[0182] 。不计算，由于在一个受试者中AUC外推>30%
[0183] 所有的值表达到3位有效数字。
【主权项】
1. 一种用于在受试者中治疗或预防表达多聚N-乙酰葡糖胺（PNAG)的细菌感染的方 法，所述方法包括对所述受试者施用治疗上有效量的抗PNAG抗体，其中所述抗体以约0. 5 至约20mg/kg的剂量施用。2. 权利要求1的方法，其中所述抗体以约10、约15、约17或约20mg/kg的剂量施用。3. 前述任一项权利要求的方法，其中施用的剂量达到至少10 y g/ml的抗PNAG抗体血 清水平。4. 前述任一项权利要求的方法，其中所述受试者血清的调理素活性在抗体施用后至少 50天保持基本恒定。5. 前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体具有至少25天的血清半衰期。6. 前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体以单剂量施用。7. 前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体以多重剂量施用。8. 权利要求7的方法，其中所述至少一个剂量的给药剂量和时间安排是基于对受试者 中的血清半衰期和/或受试者血清抗表达PNAG的细菌的体外调理素活性的确定。9. 前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体通过静脉内输注施用。10. 权利要求9的方法，其中所述静脉内输注在历时约30至约120分钟的时间内施用。11. 权利要求9的方法，其中所述静脉内输注体积是约100ml。12. 前述任一项权利要求的方法，其中所述受试者具有表达PNAG的细菌感染。13. 前述任一项权利要求的方法，其中所述受试者有患上表达PNAG的细菌感染的风 险。14. 权利要求13的方法，其中所述感染是肺感染、关节感染、心内感染、皮肤感染、软组 织感染或败血症。15. 前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体在医疗程序之前、之后或期间施用。16. 权利要求15的方法，其中所述医疗程序是将外科植入物安置于受试者中。17. 权利要求16的方法，其中所述外科植入物是支架、导管、插管、假体或起搏器。18. 前述任一项权利要求的方法，其中所述受试者是人。19. 前述任一项权利要求的方法，其中所述表达PNAG的细菌感染包括葡萄球菌属细菌 (Staphylococcus)〇20. 权利要求19的方法，其中所述葡萄球菌属细菌是表皮葡萄球菌（S. epidermidis) 或金黄色葡萄球菌（S. aureus)。21. 权利要求20的方法，其中所述金黄色葡萄球菌是甲氧西林抗性的金黄色葡萄球 菌。22. 前述任一项权利要求的方法，其进一步包括用体外调理吞噬测定来确定施用的抗 体的有效血清滴度。23. 前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体在包含如下成分的配制物中： (i) 10. 2mg/ml 的抗 PNAG 抗体； (ii) 20mM NaPO4JP (iii) 150mM NaCl, 其中所述配制物的pH是6. 5。24. 前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体是人抗体。25. 前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含 分别在SEQ ID NOs: 1、2和3中显示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列。26. 前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含 分别在SEQ ID N0s:4、5和6中显示的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。27. 前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区；所述 重链可变区包含分别在SEQ ID N0s:l、2和3中显示的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列； 所述轻链可变区包含分别在SEQ ID N0s:4、5和6中显示的IXDR1、IXDR2和IXDR3氨基酸 序列。28. 前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含 SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。29. 前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含 SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。30. 前述任一项权利要求的方法，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重 链可变区包含SEQ ID N0:7中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID N0:8中所 示的氨基酸序列。
【专利摘要】本发明提供用于治疗或预防微生物感染(例如细菌感染)的方法，在所述感染中潜在病理学涉及表达PNAG的微生物(例如表达PNAG的细菌)。本发明的方法通常涉及对受试者施用有效量的特异性地结合到PNAG的抗体。这些方法对于医源性葡萄球菌(例如，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染的治疗特别有用。
【IPC分类】A61K39/40, C07K16/12
【公开号】CN104955840
【申请号】CN201380055268
【发明人】A·雷伊, C·坎塔洛比, M·李, L·唐, D·弗洛克
【申请人】赛诺菲
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2013年8月22日
【公告号】CA2882889A1, EP2888278A1, US20150210755, WO2014031822A1