光定量PCR操作，运用Bio-Rad iQ5荧光定量PCR系统，SsoFast Eva Green Supermix(Bio-Rad)为荧光染料。本发明所选的14对内参基因（表1)以及OSPRlb和 OSWRKY引物的特异性用溶解曲线分析。
[0027] 焚光定量 PCR 的体系为 20 μ L，包含 10 μ L SsoFast Eva Green Supermix、0· 5 μ L 正向和反向引物、〇.5yLcDNA模板。PCR程序为95°C 10min;95°C 10s，56°C 20s，40个循 环；在56 °C检测SYBR Green吸光值，所有的引物都有三次重复。
[0028] 表1本研宄所选用的内参基因以及其引物序列
[0029]
[0030] 4、内参基因的筛选
[0031] 候选内参基因的表达稳定性用geNorm和NormFinder分析。引物的表达水平通过 荧光定量PCR所得到的Ct值来评估。两种分析方法分析之前，都需要将Ct值值转化为每 一基因在表达量最高样品中的相对表达值。利用geNorm软件对候选内参基因的表达稳定 性进行分析；随后用NormFinder软件确认表达最稳定的基因。
[0032] 我们首先评估内参基因表达的稳定水平，使用NCBI设计了 14对常用的内参基因 的引物，基因名、登陆号、基因注释以及引物序列都在表1中。溶解曲线和琼脂糖凝胶分析 证明每对引物都得到单一的扩增产物，引物的特异性很高，所以这些基因可用于荧光定量 PCR验证（图1A，B);其次在实验之前验证RNA的质量和完整性是十分必要的，用NanoDrop 2000分光光度计检测了总RNA的质量，琼脂糖电泳分析表明RNA是完整的（图1C)。
[0033] 最后通过分析候选内参基因在RSV侵染过程中的相对表达水平，发现不同的内参 基因表现出不同的表达水平。Ct值的范围在14-30之间，大多数都分布在22-28之间，18S rRNA和UBQlO的表达水平比其它的基因要高，然而β-TUB是表达水平最低的基因（图2A)。 由于内参基因的表达水平在不同的处理条件下是不同的，我们分析了在病毒侵染下这些候 选基因的表达是否改变。我们比较了 RSV以及对照组Ct值的变化水平（图2B)，结果表明， 每个基因在不同的处理条件下的表达时稳定的且在个处理中都表现出相同的表达水平。
[0034] 内参基因表达的稳定性可以通过相关的软件进行分析计算。geNorm程序是由 Vandesompele等（2002)开发的用于RT-qPCR内参选择的常用程序之一。该程序可以计算 出显示内参基因表达稳定性的M值，M值越大表明基因表达越不稳定，反之则稳定性越好。 结果表明UBQ 10和GAPDH是最稳定的基因，随后是EXP，UBC和18S rRNA是最不稳定的两 个基因（图3A)。
[0035] 在确定了候选内参基因的表达稳定性后，我们还需要知道用几个内参基因进行数 据的标准化才比较可靠。geNorm程序可以计算引入一个新内参基因后标准化因子的配对 差异V值，其默认阈值为0. 15。根据Vn/n+Ι比值可以判断引入一个新内参基因是否会对 标准化因子产生显著影响，如果Vn/n+Ι大于0. 15,则需要再引入第n+1个内参基因；如果 Vn/n+Ι小于0. 15,则不必再引入新的内参基因。在本实验条件下，geNorm计算获得的V值 均小于0. 15,且V3/4高于于V2/3因此选用两个内参基因已经足够满足实验所需的基本要 求（图3B)。
[0036] geNorm分析需建立在不同内参基因表达互不影响的前提下才能适用，如果内参 基因的表达在胁迫条件下相互调控，则会引起geNorm筛选结果的错误。为了进一步验 证geNorm分析所得结论，我们采用另一种常用的分析程序NormFinder进行了重新筛选。 NormFinder程序是Andersen等（2004)开发的用于独立内参基因筛选的运算程序，其输出 结果的分析与geNorm类似。NormFinder分析表明（图4)，在RSV侵染处理中UBQ 10和 GAPDH是最稳定的基因。
[0037] 实施例2,多内参基因和单内参基因校正的比较
[0038] 为了验证上述筛选的内参基因校正荧光定量PCR数据的有效性，两个病毒响应相 关基因 OsPRlb和OsWRKY作为目标基因（图5)。在RSV侵染的水稻中，UBQ 10+GAPDH分别 作为多内参基因，THMl-Like作为单内参基因进行校正比较试验。结果表明用多内参基因 校正，在病毒侵染下OsPRlb基因迅速表达，而OsWRKY在病毒侵染前期迅速表达，之后下调。 相比较而言，用TIP41-Like做单内参，OsPRlb和OsWRKY的表达水平相对较低，其辨识度明 显低于双内参系统。
[0039] 上述实施不以任何形式限定本发明。
【主权项】
1. 一种水稻黑条纹病毒（RSV)侵染植株中基因功能分析的内参基因筛选方法，其特征 在于：运用geNorm和NormFinder分析RSV侵染植株中荧光定量PCR候选内参基因的表达 稳定性，然后geNorm程序计算引入一个新内参基因后标准化因子的配对差异V值，依据V 值的变化确定最合适的内参基因组合，得到作为RSV侵染植株中基因功能分析的最优内参 基因组合-UBQ 10和GAPDH。2. 按照权利1所获得一种RSV侵染植株中基因功能分析的内参基因应用，其特征在于： 以RSV侵染的水稻植株为对象，与单内参相比，UBQ 10和GAPDH的内参基因组合能够获得 更准确和可靠的基因表达结果，该内参基因组合可用于研宄RSV侵染的水稻中相关基因的 表达水平及RSV的侵染模式。
【专利摘要】本发明公开了一种RSV侵染植株中基因功能分析的内参基因组合。本发明运用geNorm和NormFinder分析RSV侵染植株中荧光定量PCR候选内参基因的表达稳定性，然后geNorm程序计算引入一个新内参基因后标准化因子的配对差异V值，依据V值的变化确定最合适的内参基因组合，得到作为RSV侵染植株中基因功能分析的最优参基因组合-UBQ 10和GAPDH。以RSV侵染的水稻植株为对象，与单内参相比，UBQ 10和GAPDH的内参基因组合能够获得更准确和可靠的基因表达结果。本发明可用于研究RSV侵染的水稻中相关基因的表达水平、功能及RSV的侵染模式。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104975085
【申请号】CN201510323270
【发明人】周彤, 周益军, 方鹏, 杜琳琳, 兰莹, 孙枫, 刘之洋
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年6月9日