出血病病毒（EHDV)^K 泡性口炎病毒（VSV)、赤羽病病毒（AKV)、牛瘟病毒N蛋白（RPV-N)等作为抗原，分别建立间 接ELISA方法，检测杂交瘤细胞6H6培养上清。结果显示，细胞上清均不与这些抗原建立的 ELISA有特异性结合，表明该单克隆抗体具有良好的特异性。用PPRV N-ELISA检测细胞培 养上清的效价为1 : 256。
[0039] (6)杂交瘤细胞株的建立及保藏：通过三次亚克隆，建立了可稳定分泌小反刍兽 疫病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为：117-6H6,并将该细胞株送至中国典型 培养物保藏中心进行保藏，编号为：CCTCC NO. C2014233,保藏时间为2014年12月3日。
[0040] (7)腹水的制备及ELISA效价检测：选取20周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0. 5mL 降植烷，7d后腹腔注入5 X IO5个杂交瘤细胞，注射后7~IOd可见小鼠腹部明显膨大，采集 腹水，6000r/min离心5min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。用PPRV N-ELISA检测，腹 水效价为1 : 512000,分装后-80°C冻存备用。
[0041] (8)单克隆抗体的纯化：将制备的腹水采用蛋白A/G抗体纯化柱进行纯化，用 SDS-PAGE对纯化后的单抗进行分析。用核酸蛋白分析仪检测，纯化后单克隆抗体的浓度为 I. 686mg/mL，用0· 02mol/L PBS(pH7. 2)将纯化的单克隆抗体稀释至lmg/mL，-70°C保存备 用。
[0042] 步骤二：荧光微球标记小反刍兽疫病毒单克隆抗体的制备：
[0043] (1)荧光微球标记单克隆抗体复合物的制备：采用EDC介导法将纯化的单克隆抗 体和荧光微球（粒径为175nm，激发波长为470nm，发射波长为525nm，Merk公司产品）进行 偶联。具体操作为：向5mL pH 5. 0的0. 02mol/L PBS中依次加入2. 5mg荧光微球，16 μ L现 配的浓度为10mg/mL的EDC溶液，再加入浓度为lmg/mL PPRV单克隆抗体250 μ L。室温下 缓慢搅拌2h，用BSA(终浓度为2% )封闭30min后，80000r/min、4°C离心10min，移出上清 液，加入500 μ LPBS重悬沉淀物，充分混匀，将荧光微球标记抗体复合物于4°C保存备用。
[0044] (2)荧光标记抗体复合物垫的制备：用XYZ3050点样平台将荧光微球标记的单克 隆抗体复合物溶液喷于300mmX5mm玻璃纤维棉上，速度为50 μ L/cm，并于4°C真空抽干。
[0045] 步骤三：羊抗小反刍兽疫病毒多克隆抗体的制备：用纯化的PPRV免疫3月龄健康 绵羊，免疫剂量为3mg/只，间隔2周免疫1次，共免疫4次，最后一次免疫后15d，经耳静脉 采血并分离血清，用间接ELISA(PPRV-ELISA)检测抗体效价为1 : 5120。通过颈动脉放血， 分离血清，于56°C灭活30min。用A/G抗体纯化柱对多克隆抗体进行纯化，用DU-800核酸/ 分析蛋白分析仪测定IgG蛋白含量为I. 985mg/mL，用0. 02mol/LPBS(pH7. 2)稀释至I. 5mg/ mL〇
[0046] 步骤四：检测线和对照线的制备：首先将硝酸纤维素膜（35mmX300mm)粘贴于背 衬（70mmX300mm)正中表面，用纯化的羊抗PPRV多克隆抗体（1.5mg/mL)和葡萄球菌A蛋 白（SPA)(ImgAiL)分别作为检测线和对照线试剂。将两种试剂分别点在硝酸纤维膜上，点 样速度为〇. 75 μ L/cm。点样时，检测线41位于硝酸纤维素膜中线，对照线42与检测线42 之间距离为5mm。37°C干燥2h，4°C密封保存备。
[0047] 步骤五：试纸条的组装和切割：按图1所示，将背衬1和已点样检测线41和对照线 42试剂的硝酸纤维膜4、荧光微球标记小反刍兽疫病单克隆抗体复合物垫3、样品垫2、吸水 垫5粘在一起，压实后，于CM4000切条机中，将其切成3_宽的试纸条。
[0048] 根据点样速度和检测线试剂及对照线试剂的浓度，得出检测线和对照线试剂包被 量分别为〇· 3375 μ g/条和0· 225 μ g/条。
[0049] 试纸条的检测原理、结果判定标准和检测步骤：制备试纸条时，将荧光微球标记 单克隆抗体复合物固定于复合物垫上，检测线为羊抗PPRV多克隆抗体，对照线为SPA。检 测时，阳性样品中的PPRV与荧光微球标记单克隆抗体特异性地结合，在NC膜上移动时，被 检测线上的PPRV多克隆抗体捕获，荧光微球颗粒聚集于此，在荧光读取仪激发光源的激发 下，形成可见的绿色荧光条带，即检测线。相反，阴性样品中不含PPRV，在检测线处不形成绿 色荧光条带。检测线试剂SPA与荧光微球标记单克隆抗体Fc片段结合，捕获金标复合物， 形成对照线。无论样品中是否含有PPRV，荧光微球标记单克隆抗体均能与对照线试剂结合， 形成对照线。在判定结果时，若检测线和对照线同时显色，则为阳性，若检测线不显色，对照 线显色，则为阴性。若检测线和对照线均不显色或检测线显色且对照线不显色，均为无效结 果，需更换试纸条重新检测。检测时，将试纸条平放于实验台上，取100 μ L用等检样品加于 样品垫上，室温静置反应，在15min内使用荧光读取仪观察检测线和对照线显色情况，并进 行结果判定。
[0050] 实施例2本发明的一种小反刍兽疫病毒荧光免疫层析检测试纸条特异性、敏感性 和符合率试验
[0051] (1)试纸条的特异性：用试纸条分别检测份小反刍兽疫病毒（PPRV)标准阳性样 品、其它相关病毒包括蓝舌病病毒（BTV)、0型口蹄疫病毒（FMDV 0)、鹿流行性出血病病毒 (EHDV)、赤羽病病毒（AKV)、水泡性口炎病毒（VSV)、牛病毒性腹泻病毒（BVDV)阳性样品及 阴性对照样品。结果显示试纸条检测PPRV阳性样品时为阳性反应，与其它病毒阳性及阴性 对照样品时均为阴性。表明试纸条特异性良好。
[0052] (2)试纸条的敏感性：用试纸条检测系列稀释（IO1~10 7)的PPRV阳性样品，同时 用RT-PCR方法作对照，结果显示试纸条可检出IO5稀释的PPRV阳性样品，与RT-PCR检测 结果一致。
[0053] (3)试纸条与RT-PCR方法检测结果：用试纸条和RT-PCR同时检测临床样品 275份，结果如下表。根据检测结果计算得出，与RT-PCR相比，试纸条敏感性为98. 99% (76/77)，特异性为98. 70 % (196/198)，试纸条和RT-PCR检测结果之间的符合率为98. 91 % [(76+196)/275]。详细数据见表1:
[0054] 表1 :临床样品检测结果
[0055]
[0056] 本发明所制备的PPRV N蛋白特异性单克隆抗体，具有与PPRV特异性结合的活性， 并与其他相关病毒无交叉反应，表明该单克隆抗体可以用于PPRV免疫学检测方法。基利于 荧光微球标记的单克隆抗体和SPAG作为主要材料，建立PPRV免疫层析检测试纸条具有良 好的特异性和敏感性，与RT-PCR检测方法相比，两种方法检测结果符合率为98. 91 %。该 试纸条具有检测快速、操作简便、不需要专业技术人员。另外，该试纸条易于保存和运输，使 用检测样品量小，检测成本较低，操作安全，不造成环境污染。因此该方法特别适用于PPRV 的快速检测、基层兽医临床检测和养殖企业自行检测等。该试纸条的研制，为PPRV的检测、 PPR检疫和流行病学调查提供良好的工具。
[0057] 上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发 明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。
[0058] 另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开