-苯基）_乙基氛基]_2_氧代_1，2_二氛-P比 啶-3 -基} - 3H -苯并咪唑-4 -甲酸3 -氟-苄基酰胺的合成
[0117]
[0118] 采用与2 - [4 -(⑶-2 -羟基-2 -苯基-乙基氨基）-2 -氧代-1，2 -二 氢-吡啶-3 -基]-3H -苯并咪唑-4 -甲酸3 -氟-苄基酰胺相似的方法，由2 - {4 -[2 - (3 -氯代-苯基）-乙基氨基]-2 -氧代-1，2 -二氢-吡啶_3_基} -3H -苯 并咪唑-4-甲酸、苄基胺、DIEA、HATU和DMF合成2- {4- [2- (3-氯代-苯基）-乙基 氨基]-2 -氧代-1，2 -二氢-吡啶-3 -基} - 3H -苯并咪唑-4 -甲酸3 -氟-苄 基酰胺，得到2 - {4 - [2 - (3 -氯代-苯基）-乙基氨基]-2 -氧代-1，2 -二氢-P比 啶-3 -基} - 3H -苯并咪唑-3 -羧酸4 -氟-苄基酰胺。C2SH23C1FN502的LC/MS计算值： (m/e)515.0,实测值 dieOM+H).1!! NMR(互变异构体，01^0-(16)5:13.42(8，111)，11.15- 11. 46 (m, 1H), 10. 00 - 10. 91 (m, 1H), 9. 08 - 9. 41 (m, 1H), 7. 69 - 8. 00 (m, 2H), 6. 98 -7. 59 (m, 11H), 6. 22 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 4. 49 - 4. 78 (m, 2H) ,3.63 - 3. 82 (m, 2H), 3. 05 (t, J = 6. 8Hz, 2H)。
[0119] 实施例7
[0120] 2 - {4 - [2 - (3 -氣代-苯基）-乙基氛基]-2 -氧代-1，2 -二氛-P比 啶-3 -基} - 3H -苯并咪唑-4 -甲酸2 -氟-苄基酰胺的合成
[0121]
[0122] 采用与2 - [4 -(⑶-2 -羟基-2 -苯基-乙基氨基）-2 -氧代-1，2 -二 氢-吡啶-3 -基]-3H -苯并咪唑-4 -甲酸3 -氟-苄基酰胺相似的方法，由2 - {4 -[2 - (3 -氯代-苯基）-乙基氨基]-2 -氧代-1，2 -二氢-吡啶-3 -基} - 3H -苯并咪唑-4 -甲酸、苄基胺、DIEA、HATU和DMF合成2 - {4 - [2 - (3 -氯代-苯基）-乙基氨基]-2-氧代-1,2 -二氢-吡啶-3-基} - 3H-苯并咪唑-4 -甲酸2-氟-苄基酰胺，得到2 - {4 - [2 - (3 -氯代-苯基）-乙基氨基]-2 -氧代-1，2 -二 氢-吡啶-3 -基} - 3H -苯并咪唑-4 -甲酸2 -氟-苄基酰胺。C2SH23C1FN502的LC/ MS 计算值：（m/e)515.0,实测值 AieOM+H).1!! NMR(互变异构体，01^0-(16)5:13.33-13. 49 (m, 1H), 11. 14 - 11. 45 (m, 1H), 10. 05 - 10. 92 (m, 1H), 9. 08 - 9. 32 (m, 1H), 7. 70 - 7. 98 (m, 2H), 7. 02 - 7. 61 (m, 11H), 6. 16 - 6. 32 (m, 1H), 4. 53 - 4. 80 (m, 2H), 3. 43 - 3. 8-4(m, 2H), 2. 75 - 3. 12(m, 2H) 〇
[0123] 式I化合物具备有价值的特性。已经发现，这些化合物可以用于使干细胞分化为 更加成熟或成人化的肝细胞，用于更精确的药物实验和科研。本发明化合物使干细胞分化 为更加成熟或成人化肝细胞的活性可以由以下试验证明。此外，还描述了本发明化合物对 导致细胞对于HBV的敏感性的宿主基因的作用。
[0124] 人类诱导多能干细胞的体外实验
[0125] 使人类iPSC衍生的肝细胞（iCell⑩肝细胞）暴露于式I化合物的作用下，以鉴 定能更好模拟成人器官的更大功能性的条件。采用高通量、微流体定量RT - PCR(qRT - PCR) 测定贯穿肝细胞功能谱的32种基因的表达，其相较于成年的原代人类肝细胞，在hiPSC衍 生的肝细胞中是低表达的或者显示不成熟的表型。在初级筛查中，鉴定出许多化合物能够 引起许多成熟相关基因的显著增加。在二次筛查中，验证并确认了基因表达的变化，且查询 了功能性结果。
[0126] 细胞和培养条件
[0127] 根据iCell肝细胞解离和接入用户指南，将新鲜的iCell?肝细胞（第20 - 23天） 以每孔60k个细胞接种到96孔BIO胶原IV包被的培养板（BD Cat#354429)中，并进行培 养。接种4小时后，移出培养基C，替换为在培养基D中的l:50Matrigel(Cat#354227)覆 盖。接种24小时后，向在培养基D和1% DMSO中的5uM化合物施用至细胞。第三天，移出 培养基并再加入5uM化合物。第四天，收获RNA。
[0128] 基因表达谱
[0129] 米用T殊Gene Expression Cells - to - CT? Kit (Life Technologies Cat#4387299)分离样本RNA，在经化合物处理后的多个时间点于-80°C冷冻。所有样品都 米用Biomark Fluidigm 96. 96芯片（BMK - M - 96. 96)和ABI Taqman探针通过微流体定量 PCR处理。使用Biogazelle qBASE和Genorm软件计算归一化和基于模型的表达测量值。 所有样品数据均为一式三份的平均数并且相对于5个管家基因归一化以获得相对基因表 达值。用相对于溶媒对照的倍数变化来计算表达值。参见图1和2。
[0130]基于化合物改变基因表达的能力选择高击中的化合物（top compound hits)，预 计化合物通过增加细胞成熟度改变表达，例如增加成年特异标志物，或者降低胎儿特异标 志物。在二次确认筛查中，通过更广泛基因的剂量反应选择化合物。结果发现，实施例1化 合物在多个剂量时引起跨肝细胞功能的基因的总体增加（图1)。基于一组成熟相关基因的 基因表达，暴露于实施例1化合物和其它五个结构类似物（实施例2 - 7)引起iCell肝细 胞的相似表型改变（图2)。采用实施例1化合物的结果显示，在5+独立批次的iCell肝细 胞上可再现的基因表达改变，并对此进行了进一步研究，以确定其作用机制和功能性结果。 经实施例1化合物处理，根据IHV和ELISA，iCell肝细胞能被多种HBV基因型感染，并形成 大量的感染的肝细胞。
[0131] 微阵列分析
[0132] 经实施例1化合物处理的iCell肝细胞引起大量基因的上调和下调；包括干扰 素-刺激基因（ISGs)表达的动力学效应。参见图7a、7b、7c和表1。
[0133] 血清中HBV的纯化
[0134] 将200微升含有HBV的血清放入10 - 50 % Optiprep梯度的SW41管中。以 100, 000 X g于4°C离心样品2hr。在顶部收集500微升级分，对每一级分分析HBsAg (ELISA) 和HBV DNA(TaqMan PCR)。含有病毒的级分在-80°C储存。参见图6b。
[0135] 用HBV对iCell肝细胞进行感染
[0136] 根据iCell肝细胞解离和接入用户指南，将新鲜的iCell?肝细胞（第20 _ 23天） 以每孔60k个细胞接种到96孔BI0胶原IV包被的培养板（BD Cat#354429)中，并进行培 养。接种4小时后，移出培养基C，替换为在培养基D中的1:50Matrigel (Cat#354227)覆盖。 接种24小时后，用在含有1 % DMS0的培养基D中的luM实施例1化合物处理细胞。2天后 补充含有新鲜化合物的培养基。接种4天后，采用M0I (感染复数）为10的HBV对细胞进 行感染。简而言之，将纯化的病毒在含有实施例1化合物的培养基D中稀释，并与细胞一起 温育4 - 6hr或过夜。移出病毒接种物后，加入含有luM实施例1化合物的新鲜培养基，温 育细胞14天，每两天进行一次培养基更换。分析培养基中分泌的病毒抗原（HBsAg，HBeAg) 和 HBV DNA。参见图 3、4、5、6a。
[0137] 总之，数据显示，采用式I化合物作为内源的信号提供了快速、有效、非遗传且成 本划算的方法以调节iCell肝细胞功能。采用式I化合物产生感染HBV的iCell肝细胞为 基础病毒学和药物发现提供了方法。用于干细胞衍生的细胞的功能改进的小分子库筛选可 导致产生用于药物发现的新一代体外试验测试方法。
【主权项】
1. 式I化合物或其可药用的盐或酯：其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10独立为氢或卤素；且R11为氢或羟基.2. 权利要求1的化合物，其中R\R2、R3、R4和R5均为氢。3. 权利要求1的化合物，其中R^R'R3、R4或R5中至少一个为卤素。4. 权利要求1的化合物，其中Ri、R2、R3、R4或R5中至少一个为氟。5. 权利要求1的化合物，其中R\R3和R5均为氢，且R2或R4中一个为氟，另一个为氢。6. 权利要求1的化合物，其中R6、R7、R8、R9和Rw均为氢。7. 权利要求1的化合物，其中R6、R7、R8、R9和Rw中至少一个为卤素。8. 权利要求1的化合物，其中R6、R7、R8、R9和Rw中至少一个为氯。9. 权利要求1的化合物，其中R6、RS和R均为氢，且R7或R9中一个为氯，另一个为氢。10. 权利要求1的化合物，其中R11为氢。11. 权利要求1的化合物，其中R\R2、R3、R4或R5中的一个为氟，其它为氢；且R6、R7、 !^、!^、!^和一为氢。12. 权利要求1的化合物，其中R11为羟基。13. 权利要求1的化合物，其中R^R2、!?3、R4或R5为氟，其它为氢；R6、R7、R8、R9和R10为 氢，且Rn为羟基。14. 权利要求1的化合物，其为下式的化合物：15. 权利要求1的化合物，其为下式的化合物：其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10独立为氢或卤素；且R11为氢或羟基。23. 药用组合物，该药用组合物包含权利要求1的化合物及可药用的载体。24. 使干细胞分化为肝细胞的方法，所述方法包括给予所述肝细胞权利要求1的化合 物。25. 权利要求24中的方法，其中所述肝细胞被乙型肝炎病毒感染。26. 权利要求25中的方法，其中所述感染的肝细胞用于筛选治疗乙型肝炎病毒的化合 物。27. 权利要求24中的方法，其中干扰素-刺激基因在分化的肝细胞中被下调。28. 权利要求27中的方法，其中所述肝细胞被乙型肝炎病毒感染。
【专利摘要】本发明涉及式I化合物及其可药用的盐和酯，在式I中，R1–R11如说明书与权利要求书中所定义。此外，本发明还涉及制备和使用式I化合物的方法以及含有此类化合物的药用组合物。式I化合物用于使干细胞分化为更成熟或成人化的肝细胞以用作药物筛选平台和用在疾病模型应用中。
【IPC分类】C07D401/04
【公开号】CN105051023
【申请号】CN201480012330
【发明人】E·乔, M·M·哈密尔顿, S·卡米欧卡, B·伦纳德, M·特里耶特尼
【申请人】豪夫迈·罗氏有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2014年3月12日
【公告号】CA2900690A1, US9181218, US20150158840, US20150197726, WO2014140058A1