的PH450酶的表达途 径，便能加速产物的形成。下述实施细节中有描述，优选采用实验室BG-11蓝藻培养基，并 有详细的配方成分描述。
[0017]进一步，步骤S10培养到PH450酶的表达差不多稳定之后，即可停止培养。因为本 发明的目的仅仅是需要获得PH450酶产物，而不是要进行蓝藻的发酵表达，所以基本上不 需要如其他的发酵培养至衰退期；在培养的过程中随时取蓝藻细胞进行PH450酶的检测， 当检测到表达水平差不多稳定之后即可停止培养。
[0018]然后步骤S20收获培养得到的细胞，并破碎细胞去除细胞壁、细胞器等，最终收集 到总蛋白质，其中就有大量表达的PH450酶产物。
[0019]进一步，在本发明中为了提升PH450酶产物的分离纯化的品质，并且避免现有的 化学纯化方法中导致产生形状和功能结构的破坏，本发明中设计采用免疫亲和层析的方式 进行分离提纯。提纯的过程中，首先步骤S30中采用从人PH450酶标准品作为抗原进行免 疫反应，通过免疫即可得到与PH450酶特异性亲和吸附的抗体。其中免疫反应的过程可以 采用本身色素代谢比较少的动物进行，这样其产生的免疫原性更强，免疫体优选采用大白 鼠，将从人肝脏中获取的PH450酶标准品（一般获取都是含有多种亚型混合的同工酶系，或 者可以通过购买获得)，皮下注射的方式进行，免疫之后从大鼠血液中即可得到抗体，当然 活体免疫之后得到的抗体是多抗。
[0020] 之后步骤S40将步骤S30获得的多抗作为亲和配体，固定至固相载体上制备特异 性吸附PH450酶的层析柱；固相载体作为层析的载体，亲和配体与固相载体固定结合的方 式可以采用共价交联等通常方式实现。其中，能够作为亲和配体本身是基于人PH450酶免 疫得到的特异性抗体，也能够特异性吸附蓝藻大量产生的PH450酶；而层析柱中的固相介 质本发明中优选采用SepharoseCL4B(交联葡聚糖凝胶的一种）作为层析柱的固相基质， SepharoseCL4B相比其他种类的基质，具有比较好的多孔性，可以增加吸附的容量，避免 因为待测样品中的其他高丰度蛋白的竞争性造成目的蛋白吸附不足的情形。
[0021] 而最后步骤S50进行过柱分离，在层析过程的过程中，蓝藻产生的和人产生的 PH450酶还存在一些区别，人的PH450酶修饰后一般是弱碱性性质，而在蓝藻中可能由于原 核细胞代谢环境和修饰的过程不同，所以最终得到的PH450酶是弱酸性性质，所以在过柱 之前，可以用平衡液平衡改变介质的PH，提升特异性吸附的能力。在实施的过程中，为了减 少或者降低层析柱与蓝藻蛋白中其他成分的非特异性吸附，可以将制备的蓝藻总蛋白先用 只含有固相基质而不含有上述多抗配体的空柱子先过柱处理，采用该未偶联多克隆抗体只 含有固相基质的空白柱子进行过柱，目的是将其作为背景，可以引起非特异性结合的因素、 以及小颗粒碎片等等被阻留在该空白层析柱上，从而实现初步去除背景干扰，更进一步提 升多抗层析柱对于待测样品的特异性吸附的效果。
[0022] 同时在上述步骤S50中，待测样品进行过柱处理之后，可以进一步用缓冲液对亲 和层析柱进行洗涤，以去除没有结合而滞留在间质空隙内的蛋白，降低本底干扰。用于洗涤 的缓冲液可以采用任何不干扰抗原-抗体结合反应的缓冲液都可以。吸附之后最后再采用 咪唑等洗脱液进行洗脱、浓缩之后，即可分离得到纯度较高的蓝藻PH450酶。
[0023] 在本发明上述方法的实施过程中，步骤S50的过柱过程中，还可以先将提取的蓝 藻蛋白进行梯度沉降离心，因为PH450酶是7K-10K左右的蛋白，初步采用梯度离心可以 大致上除去分子量更小或者远大于上述分子量的蛋白质，进而初步过滤掉更多的非目的蛋 白，而提升目的蛋白特异性吸附过程中的竞争性优势。
[0024] 本发明的上述方法实施过程中，基于免疫亲和层析的分离方式，因为蓝藻细胞代 谢基质不如人肝脏细胞，代谢过程比较简单，生成的蓝藻PH450酶的亚型不如人肝脏中 PH450酶的亚型数量多；所以在可行的基础上如果要更好地提升亲和的单一性，也可以对 应制备蓝藻PH450酶类型的单抗，然后用单抗作为亲和配体制作层析柱。
[0025] 采用本发明的上述PH450酶的大量制备方法，基于蓝藻和人肝脏中表达的PH450 酶在蛋白质的三维结构、活性功能几乎完全相同，且蓝藻代谢过程更加简单易于诱导提升 和分离的情形，将蓝藻大量诱导培养之后，用PH450酶的特异性抗体进行亲和层析；相比现 有的基因工程菌发酵制备的方法，本发明大量制备得到的PH450酶是在蓝藻代谢中产生经 过细胞内功能修饰的活性酶，而且纯化的过程可以避免杂质的干扰，方法的效益更高。
[0026] 为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解 和实施参考，同时凸显出本发明的能够大量制备的PH450酶的性能和品质，以及方法的生 产效益，以下通过具体的实施例进行举例说明。
[0027] 实施例1 S11，配置BG-11培养基(按照微生物实验手册中记载的母液成分培养进行配置)，并同 时获取蓝藻藻种(本发明优选瑞士纳沙泰尔湖水晶蓝藻和"水生1042号"蓝藻，选用它的目 的在于比通常的国内的"水生1042号"色素代谢上比其他蓝藻更加活跃，产酶的量要高一 些，适于本发明的大量生产）；S12,之后将蓝藻藻种接种至BG-11培养基中进行培养：先将 少量的藻种转接到新鲜的培养基中，接种的比例按照30~200万细胞/ml培养基(一般尽量 多接种一些，），并且采用同期培养箱中进行；放在冷白荧光灯管（200-400f〇〇tcandle)保 持1~2天，观察最初的生长状况，生长较好以后，移到20001ux的光照下快速大量培养。并 且，每天要定期给一段时间的置于黑暗中培养，按照光暗比都是12~16h:12~8h之间进行控 制和调整。
[0028] 培养的过程中，随时进行搅拌，并将温度恒定控制24°C(-般蓝藻培养温度在 24~27°C，本发明实施中选择在24°C进行，其他技术人员也可以根据生长情况和自行喜好调 低或者调高)，同时培养箱中定期补充无菌空气，培养前期通气量相对少一些，并随着培养 时间的延长逐渐加大通气量，并是当适当地根据情况补充新鲜培养基；S13,当步骤S20培 养中培养到对数增长所减缓的时候，向培养基中添加利福平和依非韦伦至利福平的浓度为 0. 8mmol/L、依非韦伦的浓度为0. 4mmol/L;同时还添加一定量的瑞格列奈，量不需要多，添 加到0.lmmol/L即可；然后继续诱导培养，同时随时观察生长状况；S14在步骤S30实施中， 定期抽空取标准量的含有蓝藻的培养液，并洗涤离心分离其中的蓝藻细胞，用上海酶联生 物出售的用于检测cyPH450的ELISA检测试剂盒检测蓝藻的cyPH450酶的含量；当基本上 趋于稳定不增加时，停止培养收获蓝藻细胞。
[0029]S21，将步骤S14收获的蓝藻细胞用加有溶菌酶到TE溶液重悬细胞，然后用细胞超 声粉碎仪超声处理3~5次(超声功率800W，每次20min)，并且在超声处理间隔中进行1次冻 融，冻融用-20°C冰箱进行；完成之后破碎蓝藻细胞壁，得到裂解液； 522, 将步骤S21的裂解液离心，去除下层沉淀后，将上清液加大量的盐进行盐析沉淀， 之后分离沉淀得到初步分离的蛋白； 523, 将步骤S22中分离的蛋白用梯度沉降，梯度沉降之后取分子量介于3K和15K之间 的蛋白，然后备用；S31，取购买的人PH450酶(美国西格玛)2mL，与2mL弗氏完全佐剂混合， 超声波乳化完全，然后对3只大白鼠进行皮下多点注射，并于耳根静脉取血样保存； 532, 加强免疫：两周后同样再次取2mL人PH450酶，与2ml弗氏不完全佐剂混合，超声 波乳化完全，对3只大白鼠进行皮下多点注射，并于大白鼠根静脉取血样保存； 533, 将步骤S32的大白鼠血样用ELISA实验测定生成的多克隆抗体的对人PH450酶的 特异性吸附情况；当ELISA试验检测免疫的家兔血滴度达到104~105时，处死大白鼠取血。 如果ELISA试验检测结果达不到标准，那么继续重复步骤S32对大白鼠进行增强免疫，直至 达到符合标准时，处死大白鼠取血。
[0030]S34,将步骤S33处死大鼠血样中分