;美国专利号5, 429, 807 ;美国专利号5, 599, 695 ;和 美国专利号6, 368, 801))。
[0057] 将多核苷酸与底物连接可便于单独或在多重反应和反应自动化中处理多个样 品。用于确认连接产物的合适标记和捕获标签是本领域已知的，并描述于美国专利号 6, 368, 801 中。
[0058] 在RNA夹板上连接多核苷酸的特征可包括以下一个或多个：
[0059] 温度范围：可在4°C至50°C的范围内的温度，例如16°C、25°C和37°C下实现连接。
[0060] 酶浓度：可以在例如，InM-ImM酶的范围内的浓度实现连接。相对小量的RNA夹板 连接酶可用于以至少70%、80%或90%效率在RNA夹板上连接ssDNA。底物与酶的比的实 例包括 1:10 至 10:1 或 100:1 至 1:100 或 1:1000 至 1000:1 或 1:10,000 至 10,000:1 的 范围，在6小时内，例如在5小时、4小时、3小时、2小时、1小时或15分钟内完成连接。连 接的完成可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶或毛细管电泳确定。T4 DNA连接酶需要10:1至 100:1的酶与底物比，以获得反应产物并可采取超过12小时以进行可能未完成的连接。图 3 (A) -3 (B)显示RNA夹板连接酶与T4 DNA连接酶和T4 RNA连接酶之间在活性上的显著差 异的实例。
[0061] ATP浓度：在少于 I. 5mM ATP例如 I yM-lmM ATP 的范围内，例如 lmM、0. 9mM、0. 8mM、 0. 7mM、0. 6mM、0. 5mM、0. 4mM、0. 3mM、0. 2mM、0. lmM、90 uM、80 uM、70 uM、60 uM、50 uM、 40 y M、30 y M、20 y M、10 y M或I y M的ATP存在的情况下，可实现连接。使用此处提供的范 围较高一端的ATP可能是优选的，因为如果在储存过程中或在反应条件下ATP发生一些水 解，缓冲液在稳定RNA夹板连接酶反应上保持有效。此外，如果RNA夹板连接酶以腺苷酸化 形式存在，反应可在没有ATP的情况下进行。
[0062] 反应时间：可以在少于12小时内实现连接。可温育反应5分钟-60分钟，以实现 有效连接，或温育反应如上所述更长的一段时间。
[0063] pH:可以pH6- pH9范围内的pH实现连接，显示在该范围内，RNA夹板连接酶的 连接速率至少比T4DNA连接酶快10倍。
[0064] 在高和低浓度的ATP下T4 DNA连接酶和RNA夹板连接酶之间的反应速率之比：在 方法的实施方式中，在高ATP浓度下，无论底物序列如何，RNA夹板连接酶（PBCV-1连接酶） 的连接速率始终比T4 DNA连接酶或T4 RNA连接酶的连接速率大多达100:1。在低浓度的 ATP下，在针对T4 DNA连接酶的优化条件下，RNA夹板连接酶的活性比T4 DNA连接酶大至 少五倍或十倍（10:1)。
[0065] 测试所有的底物，与T4 DNA连接酶相比，使用RNA夹板连接酶在连接上稳定改善： 如上所述的改善的连接不依赖底物序列。这与使用底物敏感性的T4 DNA连接酶的连接反 应不同。例如，虽然缓慢，但T4 DNA连接酶能够在优化的低ATP条件下利用RNA夹板（SEQ ID NO: 4)连接两种寡核苷酸（SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3)，而当SEQ ID NO: 3中第一个核 苷酸从T变为G时，相同的反应条件下的T4DNA连接酶没有显示可检测的连接酶活性。相 反，RNA夹板连接酶能够高效地连接这种改变的底物以及未改变的底物。
[0066] 实际上，使用T4DNA连接酶测试的最优底物和最差底物之间反应速率差异大于 1000倍，即使使用报道的用于T4DNA连接酶的低浓度ATP(10yMATP与ImMATP)。
[0067] 使用利用RNA夹板连接酶的本实施方式，在与用于T4DNA连接酶的反应条件相同 的反应条件下，使用RNA夹板连接酶测试的相同最优底物和相同最差底物（就T4DNA连接 酶而言）之间的反应差异小于50倍，例如（小于40倍、30倍或20倍）。
[0068] 用于由RNA夹持的单链多核苷酸之间高效连接反应的RNA夹板连接酶的上述特征 可用于增强RASURASL-seq和分子倒置探针（也称为持锁探针）的方法。其它使用可包括 使用RNA夹板，通过连接短片段和随后的RNase处理（例如，使用RNaseH或其突变体）以 去除RNA夹板而促进形成长ssDNA(参见图8 (A) -8 (B))，以及检测微小RNAs(参见图10和 11) 〇
[0069] 通过RASL进行的定量mRNA分析（profiling)通常通过连接两个与感兴趣的RNA 互补的ssDNA寡核苷酸（DNA探针）而完成。在标准RASL中，分离细胞mRNA，并用以在靶标 mRNA序列存在的情况下退火的确定的DNA探针处理，以形成相邻的5'和3' DNA末端。可 通过夹板RNA连接酶连接没有间隔或错配的正确退火的结构，以形成连接的探针。探针还 包括与RNA互补区域相邻的qPCR引物区域，以使得当连接两个探针时，可通过qPCR扩增、 检测和定量产物。qPCR信号的程度可与原始样品中靶标RNA序列的量关联。由于夹板RNA 连接酶对正确碱基配对的序列和缺乏间隔的序列的强烈倾向，可检测靶标mRNA中剪接变 体和单个碱基多态性（Yeakley，et al.，（2002))。
[0070] RASL-seq是RASL的变体，在此通过总DNA测序完成检测。在RASL-seq中，用适合 于通过任何高通量DNA测序方法扩增和测序的PCR序列替换qPCR引物区域。数百种探针组 可以与RASL-seq并行运行，因此可同时定量数百种基因的表达水平（Li, et al.，（2012))。
[0071] 通过在mRNA互补区域之外合适的探针序列设计，可通过其它方法进行检测。 一个实例是环介导等温扩增（LAMP)，其中设计探针以在连接之后形成LAMP靶标结构 (Notomi，et al.，Nucleic Acids Res. ,28(12) :e63 (2000))。然后，通过 LAMP 扩增检测革巴 标RNA的存在，使得能够在场地或定点照护诊断中实现优势如等温反应条件、快速检测和 实施。在成功连接之后，可用传统的qPCR染料和如上所述的探针，或用传统方法：沉淀的焦 磷酸儀的池度检测（Mori, et. al.，Biochem. Biophys. Res. Commun.，289:150-154 (2001)); 利用金属敏感指示剂的比色检测（Tomita, et. al.，Nat. Protocols, 3(5) :877-82(2008); Goto, et al.，BioTechniques, 46 (3) : 167-71 (2009));通过焦磷酸盐转换的生物发光 (Gandelman，et al.，PLoS 0ne，5:el4155(2010));或通过归因于弱缓冲条件下扩增的pH变 化进行的检测（Pourmand, et. al.，PNAS, 103(17) :6466-70(2006);美国专利号 7, 888, 015 ; 和美国专利申请号13/799,995)进行靶标核酸扩增的检测。
[0072] 用于作为测序实验方案中初步步骤的与多核苷酸杂交的和作为Y接头的替代物 的接头包括环接头（参见例如US 20120244525)。这些包含可作为用于切割环以形成单链 末端的位点的修饰核苷酸的环接头替代物，通过与接头单链的、但非连接的末端杂交的RNA 夹板而保留该环。可在修饰和/或未修饰的核苷酸存在的情况下连接末端以在本文所述的 夹板连接酶存在的情况下形成连续的环。可在将接头与靶标DNA连接之前或之后实现这个 步骤。如果在使如上所述的两个DNA多核苷酸退火之后使用夹板产生连接，产物可为线性 多核苷酸如线性ssDNA。该途径的优点是合成长的单链DNAs的能力。
[0073] 分子倒置探针使用单线性链DNA作为探针。分子倒置探针的使用涉及设计为具有 与RNA靶标序列互补的区域的DNA探针，以使得DNA的5'和3'端退火，从而产生相邻的末 端，形成通过ssDNA的环连接的DNA/RNA杂交螺旋。在RNA互补物存在的情况下通过RNA夹 板连接酶进行的DNA末端连接形成小的环形DNA底物，用于通过例如RCA进行检测。可通 过添加RCA引物和扩增、或通过经RNAse处理去除ssRNA检测成环形的DNA，使RNA/DNA杂 交区域作为RCA的引物。然后，可通过浊度、pH变化或经凝胶读出DNA产物而检测RCA产 物（Li, et al.，Anal. Chem. ,81 (12) :4906 - 4913 (2009) ;Absalan 和 Ronaghi, Methods in Molecular Biology,396:315-330 (2007) ；Hardenbol, et al. , (2003))〇
[0074] 依靠目前使用T4DNA连接酶的RNA夹持的其它反应实例已经描述与美国专利号 6, 368, 801中。可通过用RNA夹板连接酶替换该酶改进这这些方法，包括连接酶链反应，在 连接之后进行PCR ;使用持锁探针，和使用通过连接生成的FRET检测的分子信标（Peng，et al.，Anal Chem.，82(23):9727-35(2010))。
[0075] 本文引用的所有参考文献以及2012年12月21日提交的美国申请号61/745, 244 和2013年3月14日提交的美国申请号13/829, 489通过引用并入。 实施例
[0076] 实施例1 :伸用RNA夹板测宙DNA寡核苷酸底物的连接
[0077] 体外连接测定一从多种序列制备连接酶底物。用作标准品的序列为用5'_磷酸和 3'_荧光团修饰的30nt脱氧核苷酸ssDNA片段（SEQ ID NO:3)，和20个脱氧核苷酸ssDNA 受体片段（SEQ ID N0:2)，其具有未修饰末端退火成由DNA或RNA组成的未修饰互补链（SEQ ID N0:4)。在连接缓冲液（50mM Tris pH 6-9、10mM MgCl2UmM DIT 和 IOyM ATP-ImM ATP)中在15°C-40°C下进行IOOnM标记的、预退火的寡核苷酸结构的连接。通过添加连接 酶（T4DNA连接酶或PBCV-I连接酶）至IOpM和10 y M之间的终浓度开始测定，并在16°C 或20°C下温育。用IOOmM EDTA淬灭反应，在DNA中用水稀释至InM，并通过高通量毛细管 电泳分析。
[0078] 通过高通量毛细管电泳（CE)进行片段分析一通过在总FAM-标记