CR反应：第一对引物的上下游引物各 0? 5 y 1，第二对引物的上下游引物各 0? 5 y 1，2XES Mix 5 y 1，DNA 模板 100ng±5ng，ddH20 补平至10y 1 ;
[0102] 其中，所述第一对引物的上下游引物和所述第二对引物的上下游引物的浓度均为 10 yM〇
[0103] 其中，2XES Mix是购买于生产厂家为康为世纪生物科技有限公司的商品名为 2XES Taq Mastermix 中的试剂。2XES Taq Mastermix 的产品编号为 CW0690C，规格为 10Xlml〇
[0104] 半定量PCR的反应程序为：
[0105]
[0106] 取2. 5ulPCR扩增产物采用1. 2%的琼脂糖凝胶进行检测，电压采用150v均可，电 泳时间20分钟。
[0107] 部分结果如图3所示。利用ImageJ软件进行灰度值分析，图像Type设置为8bit， 并且划区域时线条尽量光滑，确保数值有较高的可信度。对图3中条带的灰度值进行比较， 1-23泳道中，857bp条带的灰度值除以1305bp条带的灰度值，这些样本中的两条带的比值 在1. 08±0. 02之间，为纯合慢羽。其中，图3中的Marker为DM2000plus，从下往上分别为 100bp，250bp，500bp，750bp，lOOObp，2000bp，3000bp，5000bp。
[0108] 同样地，PCR扩增产物采用1%的琼脂糖凝胶进行检测，电压采用130v均可，电泳 时间25分钟，得到的灰度比值与上面一致。
[0109] 实施例5
[0110] 按照实施例1中的方法提取50份公鸡血样DNA作为PCR扩增模板，其中，公鸡包 括已知的海兰灰杂合慢羽和快羽；
[0111] 以以下PCR扩增的反应体系进行半定量PCR反应：第一对引物的上下游引物各 0? 5 y 1，第二对引物的上下游引物各 0? 5 y 1，2XES Mix 5 y 1，DNA 模板 100ng±5ng，ddH20 补平至10y 1 ;
[0112] 其中，所述第一对引物的上下游引物和所述第二对引物的上下游引物的浓度均为 10 yM〇
[0113] 其中，2 X ES Mix购买于生产厂家为康为世纪生物科技有限公司，商品名为2 X ES Taq Mastermix。2XES Taq Mastermix 的产品编号为 CW0690C，规格为 10Xlml〇
[0114] 半定量PCR的反应程序为：
[0115]
[0116] 取2. 5 y 1PCR扩增产物采用1. 2%的琼脂糖凝胶进行检测，电压采用150v，电泳时 间20分钟。
[0117] 部分结果如图4所示。利用ImageJ软件进行灰度值分析，图像Type设置为8bit， 并且划区域时线条尽量光滑，确保数值有较高的可信度。对图4中条带的灰度值进行比较， 1-3、5-15泳道中，857bp条带的灰度值除以1305bp条带的灰度值，这些样本中的两条带的 比值在1. 91±0. 04之间，为杂合慢羽公鸡；4泳道未扩增出1305bp，为快羽公鸡。其中，图 4 中的 Marker 为 DM2000plus，从下往上分别为 100bp，250bp，500bp，750bp，lOOObp，2000bp， 3000bp，5000bp。
[0118] 检测结果与实际完全吻合，由此检验该鉴定方法的准确性。
[0119] 同样地，PCR扩增产物采用1%的琼脂糖凝胶进行检测，电压采用130v，电泳时间 25分钟，得到的灰度比值与上面一致。
[0120] 本发明共测定了 86只纯合型慢羽公鸡，857bp条带的灰度值除以1305bp条带的灰 度值的比值的均值为1. 18,偏差为±0. 13 ;209只杂合型慢羽公鸡，857bp条带的灰度值除 以1305bp条带的灰度值的比值的均值为2. 19,偏差为±0. 32。
[0121] 此外，本发明采用20y 1 PCR扩增的反应体系、25y 1 PCR扩增的反应体系、30y 1 PCR扩增的反应体系、50yl PCR扩增的反应体系等等进行了验证，结果与上述10yl PCR 扩增的反应体系结果一致；
[0122] 本发明改变PCR扩增的反应体系中的模板DNA的含量，如PCR扩增体系中的模板 DNA浓度为5ng/ y 1、PCR扩增体系中的模板DNA浓度为8ng/ y 1、PCR扩增体系中的模板 DNA浓度为15ng/ y 1等等，结果与PCR扩增体系中的模板DNA浓度为10ng/ y 1结果一致；
[0123] 根据模板DNA浓度，本发明改变PCR扩增中的循环数，如循环数为20、循环数为 22、循环数为24、循环数为25等等，其结果与循环数为23结果一致；
[0124] 另外，使用本发明提供的慢羽公鸡基因型的检测方法对不同品种的1000只待测 样本进行检测，准确率为100%。
[0125] 尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的 精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中 包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
【主权项】
1. 一种慢羽公鸡基因型的检测方法，其特征在于，以纯合慢羽公鸡和杂合慢羽公鸡中 含有的特定片段重复数的不同来判断是否为纯合慢羽公鸡； 所述特定片段可通过对第一对引物进行PCR扩增； 所述第一对引物的上下游引物核酸序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述特定片段重复数的不同通过内 参基因进行比较来判断； 所述内参基因可通过第二对引物进行PCR扩增； 所述第二对引物的上下游引物核酸序列如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示。3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述特定片段重复数的不同通过内 参基因进行比较采用以下步骤进行： 具有相同基因组DNA含量的待检测样本分别采用第一对引物和第二对引物进行半定 量PCR扩增，得到第一扩增产物和第二扩增产物； 分别测定第一扩增产物的目的基因含量和第二扩增产物的目的基因含量，比较两者目 的基因的含量，判断待检测样本是否为纯合慢羽公鸡。4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述比较两者目的基因的含量，判断 待检测样本是否为纯合慢羽公鸡具体为： 将所述第二扩增产物的目的基因含量与所述第一扩增产物的目的基因含量相除，得到 的比值判断待检测样本是否为纯合慢羽公鸡； 所述比值小于1. 35,则待检测样本为纯合慢羽公鸡； 所述比值大于1. 85,则待检测样本为杂合慢羽公鸡； 优选地，所述比值为1. 05-1. 31，则待检测样本为纯合慢羽公鸡； 所述比值为1. 87-2. 51，则待检测样本为杂合慢羽公鸡。5. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述待检测样本中的基因组DNA在半 定量PCR扩增体系中的浓度为5-15ng/y 1，所述半定量PCR扩增的循环数为20-25。6. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述第一对引物和所述第二对引物 进行半定量PCR扩增在同一 PCR扩增体系中进行。7. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述半定量PCR扩增的反应体系中 含有：第一对引物的上下游引物各〇. 5 y 1，第二对引物的上下游引物各0. 5 y 1，2XES Mix 5 y 1，DNA 模板 IOOng±5ng，CldH2O 补平至 10 y 1 ; 其中，所述第一对引物的上下游引物和所述第二对引物的上下游引物的浓度均为 10 yM〇8. 根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述半定量PCR的反应程序为： ① 95 °C 5min ； ② 95°C 30s ； ③ 60cC 30s ； ④ 72cC 90s ； ⑤ 重复②③④23个循环； ⑥ 72°C 5-10min ； ⑦ 4-KTC保存。9. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述第一扩增产物的目的基因含量 和所述第二扩增产物的目的基因含量通过以下方法检测： 取等量扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳分离后，采用灰度值分析方法分析琼脂糖凝胶下 的电泳条带的DNA含量； 优选地，所述琼脂糖凝胶的质量浓度为1. 0% -1. 2%，电泳电压采用130-150V，电泳时 间为20-25分钟。10. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述待检测样本的基因组DNA的 A260/280 在 1. 8-1. 9 之间，A260/230 在 1. 6-2. 4 之间。
【专利摘要】本发明涉及基因型检测领域，特别涉及一种慢羽公鸡基因型的检测方法，以纯合慢羽公鸡和杂合慢羽公鸡中含有的特定片段重复数的不同来判断是否为纯合慢羽公鸡；特定片段可通过第一对引物进行PCR扩增；第一对引物的上下游引物核酸序列如SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2所示。本发明通过设计引物扩增出只有慢羽鸡能扩增出来的特定片段，快羽鸡扩增不出该段序列。因为公鸡基因型为ZZ，而位于Z染色体上的慢羽K基因有部分片段重复，所以在DNA初始浓度一致的情况下，理论上通过一定循环数的PCR扩增，纯合慢羽公鸡的该片段的DNA含量是杂合慢羽鸡该片段DNA含量的2倍，由此鉴定慢羽公鸡的基因型。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105132580
【申请号】CN201510679664
【发明人】李兰会, 张秀玲, 李祥龙, 臧素敏, 张乐超, 刘春杨, 周荣艳
【申请人】河北农业大学, 河北科技师范学院
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年10月19日