开的表 达或包括TGF-β 1序列和基本上类似于序列ID :2的合成多肽序列的重组蛋白。
[0085] 在另一个例示性实施例中，公开表达一种胰岛素样生长因子-I(IGF-I)。在一个例 示性实施例中，蛋白质是表达或包括IGF-I序列和合成多肽序列的重组蛋白，公开一种蛋 白，该蛋白由表达一种肝细胞生长因子（HGF)的均质重组蛋白组成。
[0086] 在另一个例示性实施例中，蛋白是根据本公开的表达或包括HGF序列和合成多肽 序列的重组蛋白。
[0087] 在另一个例示性实施例中，公开一种蛋白，该蛋白由表达一种胰岛素样生长因 子-I(IGF-I)和一种胰岛素样生长因子-2的均质重组蛋白组成。在一个例示性实施例中， 蛋白是根据本公开的表达或包括IGF-I序列、IGF-2序列和合成多肽序列的重组蛋白。 [0088] 在另一个例示性实施例中，公开一种蛋白，该蛋白由表达一种血管内皮生长因 子-A(VEGF-A)和一种血管内皮生长因子-C(VEGF-C)的均质重组蛋白组成。在一个例示性 实施例中，蛋白是根据本公开的表达或包括VEGF-A中和结构域序列、VEGF-C序列和合成多 肽序列的重组蛋白。
[0089]实您1
[0090] 在以下实例中更详细地描述本公开的方面。但是，以下实例不旨在将本公开的范 围限制于以下示出的方法或构造的精确细节。以下实例中示出并且描述实际和例示性实施 例。但是，应当理解，本领域的技术人员可在本公开的实质和范围内做出修改和改进。
[0091] 实例1 :可诜碳水化合物结合显示系统的构律
[0092] 需要一种可由此生成突变体的文库并且筛选具有期望特性的突变体的系统，该系 统包括在克隆的不同群体的可选表型和编码基因型之间的物理连锁。这种系统使用利用于 尤其在抗体工程的领域中产生较大效果的已建立的技术发展。
[0093] 在带有合适的选择性标记（M13-K07 "噬菌体"）的完整独立地功能性M13 "噬菌 体"载体，和仅包括病毒的Fl包装区域和次要外壳蛋白编码基因的"噬粒"载体中，在M13 噬菌体的次要外壳蛋白基因（基因 III)的上游框内克隆编码选择的碳水化合物结合结构 域的基因。当引入到合适的细菌宿主诸如大肠杆菌（E. coli)中并且适当繁殖时，前者载体 将产生病毒颗粒，这些病毒颗粒显示以次要外壳蛋白P3(由基因 III编码）的N末端融合 蛋白的形式在丝状病毒颗粒的一个末端处的选择的碳水化合物结合结构域的五个拷贝。
[0094] 由于当使用噬粒/辅助噬菌体系统时病毒繁殖的性质，并且类似于本领域中操 作的那样，后者载体将生成病毒颗粒，其中仅少数群体通常显示相同碳水化合物结合结构 域-P3融合蛋白的一个或更少拷贝。
[0095] 将来源于每个载体的克隆在适当条件下繁殖，这是熟悉该技术的技术人员熟知 的，并且通过ELISA针对对碳水化合物结合结构域所识别的主要碳水化合物的结合活性筛 选含有病毒颗粒的培养上层清液。在此示例中，使用复合分子，该复合分子包括远端半乳糖 基团，并且可易于通过吸附到典型96孔免疫测定板上进行固定。为了结合至碳水化合物基 团，在碳水化合物结合口袋在相邻结构域之间形成时，两个或更多个碳水化合物结合结构 域在复合物中缔合是必要的。
[0096] 在前者"噬菌体"实例中，这可能在单个病毒粒子上的相邻P3融合蛋白之间形成， 受到融合蛋白的可接受的取向约束，或在独立的病毒颗粒之间形成。使用噬粒系统，此类缔 合最可能在两个或更多个独立的病毒颗粒之间形成，因为预计在单个病毒粒子上包括两个 或更多个融合蛋白的病毒的比例非常小。
[0097] 在筛选前述克隆之后，"一价"噬粒来源克隆生成比五价噬菌体克隆显著强的 ELISA信号，后者还产生滴度低得多的感染性病毒颗粒。在此实例中噬菌体系统的不良性能 不限制该系统在所述过程中的实用性，但据信更可能是这里采用的具体遗传连锁对系统施 加的空间/取向约束，和/或融合蛋白（P3次要衣壳蛋白质是病毒感染的介体）施加的传 染性限制的作用。因此选择基于噬粒的系统，以生成并且选择变体突变体蛋白。
[0098] 实例2 :突夺体克降f库的产牛
[0099] 编码突变多肽的克隆的文库产生自来源于碳水化合物结合自组装蛋白结构域的 遗传模板。在本实例中，蛋白结构域选自细菌全毒素的A1B5组。得自已公布的数据库诸如 蛋白质数据库（Protein Data Base)的结构和功能信息和科学文献用于鉴定区域和/或特 异性残基，区域和/或特异性残基被认为有可能或被证明涉及使模板蛋白结构域形成稳定 的均五聚体、或与许多哺乳动物细胞类型的表面上发现的特异性含碳水化合物部分相互作 用的能力。这些区域/残基从后续诱变和突变体筛选轮次排除。
[0100] 在认为适当时，选择并靶向如上定义的可能易于进行突变并且不涉及期望的特性 的区域或残基以用于合理的或随机的诱变。为了最大化生成和选择与模板结构域不同的碳 水化合物结合变体的机会，对于每个顺序轮次的文库构建筛选，将突变限于有限数目的紧 靠的残基。
[0101] 根据靶向的区域或残基，突变是随机的（即包括可能地所有20种氨基酸），或功能 上尽可能合理地限制于显示出与模板结构域中发现的那些类似的生物物理和/或化学特 性的那些残基。
[0102] 在此类情况下认为相关的特性包括但不限于侧链大小、电荷、极性、疏水性/亲水 性、和参与特异性二级结构诸如α-螺旋的形成的能力。在可能/可行的情况下，将在任何 给定位置中由模板编码的残基从突变体文库中删除以避免非突变体的选择。
[0103] 通过设计寡核苷酸引物生成文库，该寡核苷酸引物包括：序列的与模板基因同源 的并使得引物（并且具体地其3'端）在适当条件下与模板DNA退火的区域，和其中包括适 当的简并性以在一个或更多个位置中编码多样化的氨基酸的区域。
[0104] 在本实例中，使用本领域中指示的那些熟悉的限定的简并性构建此类寡核苷酸， 由此在任何多样化位置中的DNA碱基按需要包含等量的2-4种碱基（G、A、T或C)。另选 地，设想更受控的多样性，由此使用从三核苷酸亚磷酰胺的位置混合物生成的寡核苷酸，使 得特异性残基（氨基酸）和它们的相对比例在每个多样化位置处受到精确控制。
[0105] 在将突变引入在任一末端处的情况下，使用一种或两种简并引物执行单个PCR反 应（并且当必要时重复），以引入所需的遗传多样性。所得产物包括（引物来源的）旁侧限 制位点，将该产物克隆到以上实例1中概述的噬粒载体中，使得变体蛋白的文库以框内遗 传融合蛋白的形式编码到Μ13噬菌体的次要Ρ3蛋白质编码基因（基因 III)。
[0106] 在期望将多样性引入到在模板基因末端远侧的区域中的情况下，使用两对引物， 使得每一对包括一个准确匹配模板序列的末端（5'或3')引物，和一个编码一些、所有所 需多样性或不编码所需多样性的简并引物。设计简并引物的3'端，使得i)每个引物准确 匹配模板序列，并且ii)每个引物与第二引物对的简并引物准确互补。
[0107] 以此方式，生成两种PCR产物，并且然后经由来源于简并引物的互补重叠序列使 彼此退火并且连接。随后将所得产物以框内遗传融合蛋白的形式与基因 III次要衣壳蛋白 基因克隆到噬粒载体中。在从先前文库筛选并且选择一种或更多种克隆的输出之后建立连 续文库，或从模板或一种或更多种选择的突变克隆平行地建立并且筛选连续文库。
[0108] 使用标准方法通过电穿孔将所有遗传构建体文库引入到宿主大肠杆菌TGl细胞 中，并且将转化体铺到选择性培养基上。在适当的温育之后，将细菌的菌落从板上刮下，并 且按需要储存和/或筛选。
[0109] 实例3 :突夺体f库的筛诜
[0110] 为了从文库选择突变体，将（文库的）培养物接种到液体培养基（2 X TY，100 μ g/ ml氨苄青霉素，1 %葡萄糖）中，使得其中包括的细胞足以包括100-1000倍的预计多样性的 表示，并且体积足以确保OD6。。在0. 1范围内。然后在约37°C下温育（伴以摇动）培养物， 直到OD6。。达到0. 4-0. 6 (即，对数期生长）。然后通过以约20辅助噬菌体每细菌细胞的比 率（OD6。。为I. 0视为约8. 0 X 10 8个细胞/毫升）添加 M13 K07辅助噬菌体，使培养物感染。 在约30min静态温育之后，将细胞再伴以摇动温育约30min。将卡那霉素添加至约50 μ g/ ml，并且将培养物在约30 °C下伴以摇动温育过夜。
[0111] 第二天上午，将培养物以约8,0008、约25-301^11离心成细胞沉淀物，并且去除上 层清液并保持。将细胞沉淀物舍弃。将20%体积的2(K)mMNaCl、20%PEG6，(KK)添加到 培养物上层清液，并且在冰上温育约Ih以沉淀噬菌体颗粒。将噬菌体以约8, OOOg沉淀约 25-30min，并且重悬浮于20 %的初始体积PBS (磷酸盐缓冲盐水）中。同样，添加20 %新体 积的200mM NaCl、20% PEG 6, 000,并且在冰上温育噬菌体约25-30min。再次将噬菌体以约 8000g沉淀25-30min，并且将沉淀物重悬浮于约2ml磷酸盐缓冲盐水（PBS)中。将所得悬 浮液转移到一个或更多个Eppendorf管中，并且以最大速度沉淀5min，以沉淀任何残余的 细菌细胞/碎片。然后噬菌体悬浮液用于选择。
[0112] 为了进行选择，用合适的抗原诸如可固定的半乳糖衍生物或B亚基的天然配体以 1-10 μ g/ml (通常5ml)涂布免疫管并且在4-8°C下过夜或在室温下放置lh。在用PBS洗涤 3-5次（通过简单地倒入免疫管中并且再倒出）之后，通过在37 °C下添加 MPBS (含有2 %乳 粉的PBS)持续1-2h来将管封闭。如上文所述洗去MPBS，并且添加约I X IO11至I X 10 12或 更多个噬菌体颗粒。
[0113] 将体积补足到约5ml，并且例如用石蜡膜将免疫管密封。然后使免疫管"翻滚"（直 立）约30min，然后静置温育约90min以允许显示来自突变体文库的能够识别固定配体的蛋 白质的那些噬菌体结合至免疫管。通过洗涤去除未结合的，或仅弱结合的噬菌体。选择的 严格性按需要根据使用的洗涤数目、用以洗涤的PBST (含有0. 1 % Tween 20的PBS)的使 用，或调节配体的涂层浓度来改变。
[0114] 通过添加 Iml IOOmM三乙胺（TEA)并且翻滚最长IOmin (更长的温育不利地影响 噬菌体生存力），然后立即倒入0.5ml IM Tris-HCKpH 7.4)中用于中和来将结合的噬菌 体颗粒从免疫管洗脱。将约0. 75ml洗脱的噬菌体添加到约IOml合适的大肠杆菌（E. coli) 菌株诸如TGl (Agilent)的对数期培养物中。将培养物在约37°C下在不摇动的情况下温育 以允许感染。将感染的细胞的样品的系列稀释液铺展到含有100 μ g/ml氨苄青霉素和1% 葡萄糖的小TYE板上。将其余细胞铺到带有相同培养基的较大生物测定板上。全部在约 30°C下温育过夜。其他0. 75ml噬菌体中，将约75 μ 1如上感染到约Iml对数期大肠杆菌 (E. coli)HB2151细胞中，并且如上将系列稀释液铺板并且温育。将其余噬菌体以甘油储备 液（约15%甘油）的形式在约-80°C下储存。
[0115] 第二天，刮下大的生物测定板以去除细胞，然后将这些细胞如先前所述以甘油储 备液的形式储存或用M13 K07辅助噬菌体生长并且"救出"以制备富集的噬菌体群体，用于 下一轮选择。通常进行二至三个顺序轮次的选择。在选择完成之后，将HB2151细胞的小系 列稀释液板的各个菌落拣取到含有约100 μ 1/孔2 X