甲酯基）-5-甲氧基-2-甲基-1氨-吗I噪-3-基）乙酷氨基）-N-径基下-2-締 酷胺 径胺钟（N肥0K)溶液的制备：14mL氨氧化钟的饱和无水甲醇溶液滴加到24mL含有 4.67g(67mmoU盐酸径胺的无水甲醇溶液中，控制内溫低于40 "C，滴加完毕，冷却反应 液，滤除白色氯化钟沉淀，所得滤液密闭保存备用。
[0030] 似-甲基3-(2-(1-(4-氯苯甲酯基）-5-甲氧基-2-甲基-1氨-吗I噪-3-基）乙 酷氨基）下-2-締酸醋（0. 46g, 1mmol)溶于10血无水甲醇后，向其中加入3. 5血上 述径胺钟（N肥0K)溶液。0. 5小时后，蒸除甲醇，2mol/L的盐酸溶液酸化至抑3-4,然后用乙 酸乙醋萃取，合并乙酸乙醋层后用饱和食盐水洗涂，经无水硫酸儀干燥，蒸干溶剂得粗品， 粗品经乙酸乙醋重结晶得0. 21g白色粉末。产率：46%，1HNMR(400MHz, (CD：3)2SO)δ 11. 30 (s,IH), 10. 54 (s,IH), 9. 11 (s,IH), 8. 70 (s,IH), 7. 76 (d,J= 8.4Ηζ, 2H), 7.53 (d,J= 8.4Hz, 2H), 7.09 (d,J= 8.8Hz,IH), 7.03 (s,IH), 6.60 (d, J= 8.8Hz,IH), 3. 74 (s, 2H), 2. 50 (s, 6H), 2. 32 (s, 3H).ESI-MS:m/z: 456.9
[M+田+。
[0031] 实施例2目标化合物抑制组蛋白去乙酷化酶活性试验（Invitro) 组蛋白去乙酷化酶（HDACs)活性巧光分析方法主要分两步：第一步，含一个乙酷化侧 链的赖氨酸HDACs巧光底物（Boc-Lys(acetyl) -AMC)，用含组蛋白去乙酷化酶的化la细 胞提取物样本(包含HDAC1,HDAC2,HDAC3和HDAC8)解育，使底物脱去乙酷基，激活底物。 第二步，用膜酶水解Boc-Lys-AMC，产生AMC运一巧光基团（即发色团)，在发射波长/激发波 长（390nm/460nm)测定巧光强度，从而根据抑制剂组及对照组的巧光强度计算抑制率，并求 算IC50值。酶活性测试原理见本专利说明书部分相关内容。实验结果见表1。
[0032] 表1.似-3-(2-(1-(4-氯苯甲酯基）-5-甲氧基-2-甲基-1氨-吗I噪-3-基） 乙酷氨基）-N-径基下-2-締酷胺（I)的体外抑酶试验结果
SAHA商品名为Zolinza，通用名为Vorinostat，为美国食品药品监督管理局（FDA)于 2006年批准上市的组蛋白去乙酷化酶抑制剂。
[0033] 上述测试结果表明，似-3- (2- (1- (4-氯苯甲酯基）-5-甲氧基-2-甲基-1氨-吗I 噪-3-基）乙酷氨基）-N-径基下-2-締酷胺表现出对组蛋白去乙酷化酶较强的抑制活性， 并且在测试中对组蛋白去乙酷化酶的抑制活性优于阳性对照药Vorinostat(SAHA)，具有 良好的开发前景，并可作为发现新型高效组蛋白去乙酷化酶抑制剂的先导化合物。
[0034] 实施例3目标化合物抑制细胞增殖的活性试验（Invitro) 对似-3- (2- (1- (4-氯苯甲酯基）-5-甲氧基-2-甲基-1氨-吗I噪-3-基）乙酷氨 基）-N-径基下-2-締酷胺进行体外抑制癌细胞增殖的活性试验，结果见表2。
[00对术语说明： U937 :人组织细胞淋己瘤细胞株。
[0036]K562 :人红白血病细胞株。
[0037] 化60 :人急性白血病细胞株。
[0038] SAHA :商品名为Zolinza，通用名为Vorinostat，为美国食品药品监督管理局 (抑A)于2006年批准上市的组蛋白去乙酷化酶抑制剂。
[0039] DMS0:二甲基亚讽。
[0040] ICs。：半数抑制浓度。
[0041] 1.[材料]U937，K562,化60细胞株，四甲基偶氮挫蓝ΜΤΤ,ΙΟ%胎牛血清，96孔板。 [004引2.[方法] 细胞培养U937，K562,化60S种肿瘤细胞株都采用常规培养。实验时均用对数生长期 细胞。
[004引细胞生长检测（MTT法）肥T116,SK0V3,化60细胞悬液均调整至1XlOVml，分别接 种于96孔板巧0μ1/孔），5000个细胞/孔。铺板4h后，每孔中加入50ul含不同浓度化 合物的培养基，使孔中化合物终浓度分别为：l〇〇〇、200、40、8、l. 6、0. 3化g/ml，每个浓度设Ξ个复孔，不加细胞的孔读数时作空白，加细胞不加化合物的孔作化合物空白孔，SAHA作化 合物阳性对照。于37°C，5%二氧化碳中解育48h，每孔加入10μ1 0. 5%的MTT染色液，继 续解育4h后，2500巧m，离屯、30min，然后抛弃板孔中培养基，加入二甲基亚讽，200ul/孔。 酶标仪上于570nm处测定每孔的吸光度OD值，细胞生长抑制率按下式计算：
上表测试数据表明，化合物巧)-3-(2-(1-(4-氯苯甲酯基）-5-甲氧基-2-甲基-1 氨-吗I噪-3-基）乙酷氨基）-N-径基下-2-締酷胺在体外抗肿瘤细胞增殖的试验中显示 出优于阳性对照SAHA的活性，具有良好的开发前景。
【主权项】
1. 组蛋白去乙酰酶抑制剂，（E)-3-(2-(l-(4-氯苯甲酰基）-5-甲氧基-2-甲基-I 氢-吲哚-3-基）乙酰氨基）-N-羟基丁-2-烯酰胺，具有结构式（I)的化学结构，以及其 药学上可接受的盐，2. 权利要求1组蛋白去乙酰酶抑制剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： 合成路线：以吲哚美辛为原料，先与3-氨基巴豆酸甲酯缩合，再与羟胺钾亲核反应，最 后制得终产物；反应式如下： 合成路线：上述合成路线反应式中的试剂：（1) 3-氨基巴豆酸甲酯，O-苯并三氮 唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸，三乙胺，二氯甲烷；（2)羟胺钾，无水甲醇。3. 根据权利要求2所述的组蛋白去乙酰酶抑制剂的制备方法，其特征在于：反应路线1 制备所述组蛋白去乙酰酶抑制剂的中间体的方法，该中间体是：(E)-甲基3-(2-(1-(4-氯 苯甲酰基）-5_甲氧基-2-甲基-1氢-吲哚-3-基）乙酰氨基）丁-2-烯酸酯。4. 根据权利要求1所述的组蛋白去乙酰酶抑制剂在制备预防或治疗与组蛋白去乙酰 化酶活性异常表达相关的哺乳动物疾病的药物中的应用。5. 根据权利要求4所述的组蛋白去乙酰酶抑制剂的应用，其特征在于：所述的与组蛋 白去乙酰化酶活性异常表达的相关哺乳动物疾病包括：癌症，神经变性疾病，病毒感染，炎 症和糖尿病。6. -种适于口服给予哺乳动物的药物组合物，包含权利要求1所述的组蛋白去乙酰酶 抑制剂和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
【专利摘要】本发明属于药物化学技术领域，尤其涉及组蛋白去乙酰化酶抑制剂及其制备方法和应用。本发明提供了一种强效的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，本发明涉及具有结构式(I)的化合物，还涉及其顺反异构体，药学上可接受的盐，溶剂合物以及前药。本发明还涉及含有结构式(I)化合物的药物组合物及其制药用途。可有效治疗组蛋白去乙酰化酶活性异常表达的疾病。。
【IPC分类】A61P25/28, A61P29/00, A61P3/10, A61K31/405, A61P35/00, A61P31/12, C07D209/26
【公开号】CN105348169
【申请号】CN201510782517
【发明人】张磊, 韩彦弢, 边江, 张剑, 徐文芳
【申请人】青岛大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月16日