产物经1.0%质量体积比琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒纯化回 收后，连接到PMD18-T载体，用热激法转化大肠杆菌DH5a菌株的感受态细胞，涂布于含有氨 苄青霉素50mg/L的LB固体培养基，37°C培养过夜，菌落PCR检测和测序验证正确后，获得 C1CP2基因的启动子pClCP2全长序列；
[0020] 步骤4:用KpnI、XbaI将连有C1CP2基因的启动子序列的PMD18-T载体进行双酶 切，纯化回收；同时用ΚρηI、XbaI将pBI121载体进行双酶切，去除CaMV35S启动子，酶切产 物用1.0%质量体积比琼脂糖凝胶电泳检测并回收大片段；
[0021]步骤5:在10ul体系中，将回收的PBI121载体大片段和回收的PCR产物用T4连接酶 16°C连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，将筛选得到的阳性克隆用ΚρηΙ、 XbaI进行双酶切验证，获得表达GUS基因的植物重组表达载体pBI-pClCP2。
[0022] 此外，西瓜C1CP2基因启动子的应用，其特征在于应用于模式植物拟南芥的花药、 花粉粒及根。在该启动子的驱动下，目的基因主要在植株的根、花药中表达，在种子中不表 达，该启动子在转基因安全(食用、花粉漂流)中具有良好的应用价值。
[0023] 本发明的有益效果在于:首先，西瓜CP2基因启动子制备方法操作简单，结果稳定 可靠。其次，来源于西瓜内源的启动子能够精确定位所调控的基因，驱动目的基因在转基因 西瓜的特定组织或时期表达，避免造成植物自身能源和物质的浪费。第三，重组载体大小适 合，在植物中易与转化，所带有的标记基因⑶S表达强度高，容易检测，提高了外源基因在转 基因植物中的表达效率。因此，该启动子可应用于植物基因工程研究和西瓜转基因安全研 究。
【附图说明】
[0024] 图1为一种同源克隆法扩增西瓜CP2基因启动子的片段电泳图
[0025]泳道1代表基因组DNA为模板PCR扩增结果;泳道Μ代表DL2000的核酸Marker;
[0026]图2为西瓜CP2基因的启动子序列中含有的顺式作用元件的分析结果图；
[0027]图3为一种构建的pBI_pClCP2载体示意图；
[0028] 图4为一种转化载体pBI_pClCP2的部分转基因植株PCR鉴定图
[0029] 泳道Μ代表DL2000的Marker;泳道1.WT植株；2.pBI-pClCP2阳性质粒的PCR扩增结 果;3-17.转基因植株的PCR扩增结果；
[0030] 图5为一种C1CP2启动子驱动GUS基因表达的组织化学染色结果；
[0031 ] A:20日苗(整株蓝色）；B:茎(切口处蓝色）；C:叶片(伤口处蓝色）；花序：（中晚期花 瓣、花药、柱头、花丝蓝色）；D:角果(无色）；
[0032]图6为西瓜启动子的序列为SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列；
【具体实施方式】
[0033]以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明：
[0034]本发明中，西瓜CP2基因（Cla016594)的启动子，命名为pClCP2,其核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。该序列长度为2014bp。通过对该启动子序列中的顺式元件进行预测分析， 发现C1CP2基因的启动子在位置一 111~一 170处有3个CAATbox，在一 189~一 194位置有有 一个TATAbox，在一597~一603处有一个TATAbox。此外，还具有8个花粉特异性启动子活 性相关元件P0LLEN1LELAT52(AGAAA序列元件）；8个花粉特异性表达基因G-10相关元件 (GTGA);6个与创伤有关的WRKY710SIbox序列元件（TGAC);3个MYB类转录因子结合位点 MYBC0RE序列元件(CNGTTR)等。
[0035] 一种西瓜C1CP2基因的启动子，该西瓜启动子的序列为SEQIDNo. 1所示的核苷酸 序列。
[0036] -种用于获得上述西瓜启动子的引物对，其特征在于:所述引物对为：
[0037]pClCP2FP：5/-(KpnI)CGGGGTACCAAGAGACGACGAATGCCAATA~3'；
[0038]PClCP2RP：5/-(XbaI)CTAGTCTAGATTTCACCGCTAAGAATCGAAG~3/。
[0039] -种上述西瓜C1CP2基因的启动子的制备方法，它包括如下步骤：
[0040] 步骤1:根据西瓜全基因组测序获得的C1CP2基因上游5'端2kb左右序列设计1对引 物进行PCR扩增，获得西瓜C1CP2基因5'端上游2kb启动子序列，所用引物为：
[0041]pClCP2FP：5/-(KpnI)CGGGGTACCAAGAGACGACGAATGCCAATA-3 '；
[0042]pClCP2RP:5/-(XbaI)CTAGTCTAGATTTCACCGCTAAGAATCGAAG-37 ；
[0043] 步骤2:根据西瓜全基因组测序获得的C1CP2的基因5'端上游2kb启动子序列设计 所用的引物pCICPSFPj'-KpnI)CGGGGTACCAAGAGACGACGAATGCCAATA-3' ；和pClCP2RP: 57-(XbaI)CTAGTCTAGATTTCACCGCTAAGAATCGAAG-3'，利用CTAB法提取西瓜叶片基因组 DNA，以该提取的DNA为模板进行聚合酶链式反应扩增，得到目的基因上游2014bp侧翼序列， 经过生物信息学分析此序列为C1CP2的启动子全长序列，命名为pClCP2。
[0044]上述技术方案的步骤2中，以提取的DNA为模板进行PCR扩增的具体方法为:提取西 瓜基因组DNA20μ1，以此为模板进行扩增，反应体系为50μ1，分别添加lOXExTaqbuffer δμL,δ'端引物 1μ1，3'端引物lyl，dNTP4yl，ExTaq0.5yl，DNA模版ΙμL约 100ng，ddH20 37.5 μL，扩增产物大小为2010bp，PCR程序为94°C预变性5min，94°C变性lmin，58°C退火lmin，72 °C延伸2min，32个循环，72°C复性lOmin，16°C保存4h，PCR产物经1.0 %质量体积比琼脂糖凝 胶电泳检测，凝胶回收试剂盒纯化回收后，连接到PMD18-T载体，然后采用热激法转化大肠 杆菌DH5a菌株的感受态细胞，挑取阳性克隆，PCR检测阳性和酶切验证后测序，得到目的基 因上游2014bp侧翼序列，经过生物信息学分析此序列为C1CP2基因的启动子全长序列，命名 为PC1CP2。
[0045] 一种上述西瓜PC1CP2启动子的植物表达载体pBI-pClCP2的制备方法，它包括如下 步骤：
[0046]步骤1:以核苷酸序列为SEQIDNo. 1的西瓜启动子为模板设计引物对，且引物对 分另|J添加ΚρηI、XbaI酶切位点：pC1CP2FP: 5 ' _ (ΚρηI)CGGGGTACC AAGAGACGACGAATGCCAATA-S'和pClCP2RP:57-(XbaI)CTAGTCTAGA TTTCACCGCTAAGAATCGAAG-37 ；
[0047] 步骤2:以核苷酸序列为SEQIDNo.l的西瓜启动子为模板进行PCR扩增，94°C预变 性 5min，94°C变性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸 2min，32 个循环，72°C复性lOmin，16°C保存 4h，获得PCR产物；
[0048] 步骤3:聚合酶链式反应产物经1.0%质量体积比琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收 试剂盒纯化回收后，连接到PMD18-T载体，用热激法转化大肠杆菌DH5a菌株的感受态细胞， 涂布于含有氨苄青霉素50mg/L的LB固体培养基，37°C培养过夜，菌落PCR检测和测序验证正 确后，获得C1CP2的启动子pClCP2全长序列；
[0049] 步骤4:用KpnI、XbaI将连有C1CP2的启动子序列的pMD18-T载体进行双酶切，纯化 回收；同时用Kpnl、XbaI将pBI121载体进行双酶切，去除CaMV35S启动子，酶切产物用1.0% 质量体积比琼脂糖凝胶电泳检测并回收大片段；
[0050] 步骤5:在10ul体系中，将回收的PBI121载体大片段和回收的PCR聚合酶链式反应 产物用T4连接酶16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5a菌株感受态细胞，将筛选得到 的阳性克隆用KpnI、XbaI进行酶切验证，获得表达GUS基因的植物重组表达载体pBI-pClCP2〇
[0051] 上述技术方案的步骤2中，聚合酶链式反应扩增的条件如下