手段。
[0031] 实施例1特异性靶向TWIST1基因的SiRNA的设计合成及转染黑色素瘤细胞 [0032] 1、特异性靶向TWIST1基因的siRNA的设计
[0033]在公共的siRNA设计网站（网址为：http://sirna.wi.mit.edu/home.php; https: //www.thermofisher·com/cn/zh/home.html;http: //sidirect2.rnai·jp/等）上输 入TWIST1的mRNA序列，按照网站指示预测可以敲低TWISTImRNA表达的siRNA序列。
[0034] 比对多个网站的给出的预测结果，选择在至少同时在两个网站均被预测到的 siRNA〇
[0035] 筛选未有文献报道的siRNA序列。本实施例筛选的siRNA序列GC含量为52.63%，且 正义链和反义链的长度均为19nt。
[0036] 具体来说，其正义链和反义链序列分别为：
[0037]正义链：5'CCGGAGACCUAGAUGUCAUdTdT-3'（SEQIDN0.1)
[0038] 反义链：5'-dTdTGGCCUCUGGAUCUACAGUA-3'（SEQIDN0.2)。
[0039] 本发明的小干扰RNA作用于TWIST1基因的靶序列为:5 ' -CCGGAGACCTAGATGTCAT-3 ' (SEQIDNO.3)〇
[0040] SiRNA及阴性对照序列交由广州锐博生物科技有限公司合成。
[0041] 2、本发明的siRNA转染黑色素瘤细胞
[0042] 黑色素瘤细胞A375(购自ATCC，Americantypeculturecollection)在 10cm培养 皿中培养至80 %后，用胰酶消化，加入6孔板，使每个孔的最终细胞数为5X105个细胞。
[0043]转染试剂准备：
[0044] Α.250μ1Opti-MEM(赛默飞世尔科技，美国）+5μ1siRNA(20uM)，静置 5 分钟。
[0045]Β·250μ1Opti-MEM(赛默飞世尔科技，美国）+3μ1Lipofeactmine2000(赛默飞世 尔科技，美国），静置5分钟，
[0046] C.将A与B所得试剂混合后，静置20分钟。将混合后的转染试剂加入6孔板中，与 A375细胞混匀。37°C，培养48小时后，收集细胞。
[0047] 实施例2siRNA转染后鉴定TWIST1基因的mRNA表达水平
[0048] 1、实时定量PCR(q-PCR)鉴定实施例1中转染了本发明siRNA的黑色素瘤细胞A375 的TWIST1基因的mRNA表达水平
[0049]表lq-PCR反应体系
[0051]前引物:AGCTACGCCTTCTCGGTCT
[0052]后引物：CCTTCTCTGGAAACAATGACATC。
[0053]q-PCR反应程序：95°C5min; 95°C15sec，62°C30sec，循环 35 次。
[0054]使用实时定量自带软件分析TWIST1基因表达量的水平，结果见图1。图1显示，A375 细胞转染TWIST1特异性siRNA后，TWIST1表达量仅相当于转染阴性对照序列(NC)的52%。1: 未转染siRNA的A375细胞;2:转染阴性对照序列的A375细胞;3:转染siRNA的A375细胞。
[0055] 将PCR产物进行电泳检测，A375细胞中TWIST1基因mRNA敲低水平的电泳检测结果 见图2,图2显示转染siRNA后，可以有效的敲低TWIST1基因的表达。
[0056]实施例3siRNA转染后鉴定TWIST1蛋白表达水平
[0057] l、Western blot鉴定TWIST1基因的蛋白表达水平
[0058]样品准备：贴壁的黑色素瘤细胞A375:1 X PBS洗两遍，100μΙ胰酶消化，500μ1培养 液终止放入1.5ml ΕΡ管中。用14000rpm的转速离心5分钟。弃上清，200μ1 1 X roS洗一次。加 入50μ1细胞裂解缓冲液，剧烈震荡，使细胞充分裂解，-20°C保存。用BCA方法检测总蛋白量。 5 X上样缓冲液稀释到1 X，加入到裂解的细胞样品中。95°C热变性5min，随后用11500rpm的 转速离心5分钟。
[0059] 2、配置12%505^^^胶。
[0000] 3、蛋白质电泳：点样，每个样品最少20yg，蛋白分子量标记点3μ1。丨旦压100V，30分 钟，随后调整电压至120V，1小时。转膜:纤维素膜预先用甲醇浸泡，用预冷的转膜缓冲液进 行转膜，恒流300mA，2小时。封闭：将膜放入5 %脱脂奶粉溶液（lg脱脂奶粉+20ml1XTTBS) 中，振荡1小时。倒掉脱脂奶粉溶液，加入一抗，振荡1小时。去掉一抗后，用1XTTBS洗三次， 每次10分钟。随后加入二抗，振荡1小时。去掉二抗后，用1XTTBS洗三次，每次10分钟。配制 显色液并均匀滴在膜上，曝光显影。将三种细胞总蛋白进行Westernblot检测，结果见图3， 结果显示转染siRNA后，可以有效的敲低TWIST1蛋白的表达。
[0061]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种小干扰RNA，其特征在于，其GC含量为52.63%，且正义链和反义链的长度均为 19nt〇2. 如权利要求1所述的小干扰RNA，其正义链和反义链序列分别为： 正义链：5 'CCGGAGACCUAGAUGUCAUdTdT-3 '， 反义链:5 ' -dTdTGGCCUCUGGAUCUACAGUA-3 '。3. 如权利要求2所述的小干扰RNA，其特征在于，小干扰RNA作用于TWIST1基因的靶序列 为：5 '-CCGGAGACCTAGATGTCAT-3 '。4. 一种编码如权利要求1-3任一所述的小干扰RNA的DNA序列。5. -种表达载体，其包括权利要求4所述的DNA序列。6. -种含有权利要求1-3任一所述小干扰RNA的药物。7. 如权利要求6所述的药物，其为抗肿瘤药物。8. 权利要求1-3任一所述的小干扰RNA在制备调节细胞或生物体中的TWIST1基因表达 药物中的用途。9. 权利要求1-3任一所述的小干扰RNA在制备抑制肿瘤细胞迀移和侵袭的药物中的用 途。10. 权利要求1-3任一所述的小干扰RNA在制备治疗疾病的药物中的用途，所述的疾病 为黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、食道鳞状细胞癌和胰腺癌。
【专利摘要】本发明提供了一种特异性抑制TWIST1基因的小干扰RNA及其应用。本发明小干扰RNA的正义链和反义链序列分别如SEQ？ID？NO.1-2所示。该小干扰RNA干扰的TWIST1靶序列如SEQ？ID？NO.3所示，其通过作用于TWIST1靶序列实现抑制TWIST1基因表达，可用于制备调节细胞或生物体中TWIST1基因表达的药物，也可用于制备治疗肿瘤、尤其是黑色素瘤的药物，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】A61K31/713, A61P35/00, C12N15/113, A61P35/04, C12N15/11
【公开号】CN105462976
【申请号】CN201510958364
【发明人】方向东, 赵华, 李永君, 杨琼
【申请人】中国科学院北京基因组研究所
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月18日