GCGACCCTTCACGGTGTACTGGATC(SEQ ID N0:4)；
(2)BstDNA聚合酶:浓度为8 U/yL，分装100 yL放入一个新的1.5 mL离心管中；
(3)10 X反应缓冲液:包含200 mmol/L Tris-HCUpH 8.8,100 mmol/L KC1，100 mmol/L (NH4)2S04，80 mmol/L MgSCU和8 mol/L甜菜碱，分装250 入一个新的 1.5 mL离心管中；
(4)dNTPs溶液，由浓度分别为10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成，分装500此放入一个新的1.5 mL离心管中；
(5)显色剂:1000XSYBRGREEN I荧光染料，分装200 yL放入一个新的棕色1.5 mL离心管中。
[0021 ]用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测:
(1)提取待测样品的基因组DNA:采用北京天根公司生产的植物DNA提取试剂盒方法，提取待测样品的基因组DNA，稀释至25 ng/yL；
(2)配制待测样品的LAMP检测反应体系:采用25yL的反应体系，在200 yL反应管内依次加入超纯水15.5 yL、模板DNA 2 yL、检测引物溶液1 yL、Bst DNA聚合酶1 yL、10X反应缓冲液2.5 yL、dNTPs溶液3 yL；
(3)在反应管盖上加1yL的显色剂，盖到反应管上；
(4)运行LAMP扩增反应:将反应管放置在恒温水浴锅中，65°C孵育60min，80°C孵育5min终止反应；
(5)LAMP扩增结果的鉴定:颠倒反应管，使管盖上的显色剂与反应溶液充分混合，若反应管显现绿色则为阳性，若显现橙色则为阴性。
[0022]实施例2试剂盒及检测方法的特异性实验。
[0023]按实施例1所述的试剂盒制备方法准备试剂盒，并对其检测方法进行特异性测试:
(1)提取转(^}^116基因玉米]^093034、转(^71(]基因水稻1'1(3-19、转(^71?基因玉米TC1507、转cry34Ab和cry35Ab基因玉米59122、转￥丨口3六基因]\01?162、转(11110基因大豆M0N87708、转aadl基因玉米DAS40278-9和非转基因玉米等8种试验材料的基因组DNA，用ND1000核酸微量测定仪测定DNA浓度，用超纯水稀释至25 ng/yL；
(2)在200yL的八联管中，按照实施例1所述的步骤，在每个管中依次加入超纯水15.5yL、检测引物溶液1 yL、Bst DNA聚合酶1 yL、10X反应缓冲液2.5 yL、dNTPs溶液3 yL，然后在 1-8号管中分别加入2 yL的 IE09S034、Tlc-19、TC1507、59122、MIR162、M0N87708、DAS40278-9、非转基因玉米样品的DNA对照；
(3)在八联管盖的每个管盖上加1uL的显色剂，盖到八联管上；
(4)运行LAMP扩增反应:将八联管放置在恒温水浴锅中，65°C孵育60min，80°C孵育5min终止反应；
(5)LAMP扩增结果的鉴定:颠倒反应管，使八联管盖上的显色剂与反应溶液充分混合，若反应管显现绿色则为阳性，若显现橙色则为阴性。
[0024]本实施例中，仅在含有vip3A基因的转基因玉米MIR162样品管中显现绿色，表明本发明所述的试剂盒及检测方法对vip3A基因具有很好的特异性。
[0025]应当说明的是，上述实施例为本发明的具体实施例子，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.转基因植物中Vip3A基因的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP，其核苷酸序列分别如下所示: 外引物F3:AGGAGGACAACCTGGAGC(SEQ ID N0:1)； 外引物B3:TCGTCCTTCAGGTGAATCGA(SEQ ID N0:2)； 内引物FIP:GCACGTACAGGGCCTTGGTGAGGCCAACAACAAGAACGC(SEQ ID NO:3); 内引物BIP:TCAGCCAGTTCATCGGCGACCCTTCACGGTGTACTGGATC(SEQ ID NO:4)。2.转基因植物中vip3A基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分: (1)检测引物溶液:由权利要求1所述的4条引物配制的检测引物溶液，外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP的浓度依次为4?6 ymol/L、4?6 ymol/L、32?48 ymol/L、32?48ymol/L; (2)具有链置换活性的BstDNA聚合酶:浓度为7?9 U/yL； (3)10X反应缓冲液:200 mmol/L Tris-HCUpH 8.8,100 mmol/L KC1，100 mmol/L(NH4)2S04，40?100 mmol/L MgS〇4，6?14 mol/L甜菜喊； (4)dNTPs溶液，由浓度分别为10mmo 1/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成； (5)显色剂:1000XSYBRGREEN I荧光染料。3.根据权利要求2所述的vip3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述的检测引物溶液中含有5 ymol/L外引物F3、5 ymol/L外引物B3、40 ymol/L内引物FIP、40 ymol/L内引物 BIP。4.根据权利要求2所述的vip3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述的BstDNA聚合酶的浓度为8 U/yLo5.根据权利要求2所述的vip3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述的10X反应缓冲液中MgS04、甜菜碱的浓度分别为80 mmol/L,8 mol/L。6.利用权利要求2?5任一项所述的试剂盒检测vip3A基因的方法，包括以下步骤: (1)提取待测样品的基因组DNA； (2)配制待测样品的LAMP检测反应体系:在200yL反应管内加入模板DNA 2-5 yL、检测引物溶液1 yL、Bst DNA聚合酶1 yL、10X反应缓冲液2.5 yL、dNTPs溶液2~5 yL，用灭菌去离子水或超纯水补齐至总体积为25 yL； (3)在反应管盖上加1yL的显色剂，盖到反应管上； (4)运行LAMP扩增反应:将反应管放置在恒温水浴锅中，65°C孵育60min，80°C孵育5min终止反应； (5)LAMP扩增结果的鉴定:颠倒反应管，使管盖上的显色剂与反应溶液充分混合，若反应管显现绿色则为阳性，若显现橙色则为阴性。
【专利摘要】本发明公开了一种转基因植物中<i>vip3A</i>基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。引物组由4条特异性引物组成，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1~4所示。检测试剂盒包括检测引物溶液、具有链置换活性的DNA聚合酶、10×反应缓冲液、dNTPs溶液、显色剂。检测方法是采用特异性引物及具有链置换活性的DNA聚合酶，在63~65℃对样品DNA模板进行扩增，并采用加入显色剂观察颜色变化的方法，判断样品是否含有<i>vip3A</i>基因成分。本发明不需要特殊仪器，具有快速高效、操作简便、特异性强等特点，适合现场检测。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105483238
【申请号】CN201510987631
【发明人】李飞武, 夏蔚, 闫伟, 邵改革, 李葱葱, 董立明, 邢珍娟, 刘娜
【申请人】吉林省农业科学院
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月26日