一种降胆固醇菌制剂及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体设及一种菌制剂及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 随着乳酸菌对人体健康有益作用机理的不断深入研究和掲示，乳酸菌产品越来越 受到消费者的重视。菌制剂W及经菌制剂发酵得到的发酵乳制品的关注度不断得到提升， 直投式菌制剂W及直投式酸奶发酵剂因其活力强、含菌量高、菌量稳定，保存期长、耐储运， 使用方便，发酵产品稳定等优点而成为了市场热点与研发热点。作为提升发酵剂活力的关 键工艺，冻干保护剂能有效防止细菌细胞死亡，保证活菌量和延长菌种保藏期。
[0003] 目前乳酸菌菌制剂可采用真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等不同的方法进行制备， 而其中真空冷冻干燥比较常用且有优势，其基本原理是热力学相平衡理论：即将欲保藏的 微生物细胞悬浮液冻结后，在真空条件下使冰升华，最后达到干燥。该方法主要是根据微生 物生理、生化特点，使微生物的代谢不活泼，生长繁殖受到抑制，达到休眠状态，W保特菌株 原有特性。
[0004] 真空冷冻干燥过程中影响乳酸菌发酵剂菌体存活率、发酵活力及胆藏稳定性的主 要因素有:培养基、培养条件、收获期、起始细胞浓度、冻干保护剂介质、冷冻速度、干燥过 程、水分活度、包装方式、保藏溫度和复水条件等，其中冻干保护剂是最为关键的因素。由于 不同的保护剂对不同菌种的保护效果不同，如果冻干工艺中保护剂选择不当，将导致菌体 的存活率下降。
[0005] 直投式发酵剂是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻干燥发酵剂菌种，可直接加入 热处理的原料进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其他预处理工作。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种菌制剂，由植物乳杆菌化ac tobac i 11US P 1 an tarum subsp.plantar皿)CICC NO.6240和保护剂组成。
[0007] 本发明所述植物乳杆菌CICC NO.6240,属于植物乳杆菌植物亚种，拉下文名称为 Lactobaci 1 lus Plantarum subsp. Plantarum，在本发明申请日前就是已知的生物材料。 [000引本发明所述植物乳杆菌CICC NO.6240保藏于位于北京市朝阳区酒仙桥中路24号 院6号楼的中国工业微生物菌种保藏管理中屯、（化ina Center of Industrial Culture Collection,CICC)。此外，本发明所述的植物乳杆菌CICC NO.6240同时还保藏于其他的生 物材料保藏中屯、，包括:保藏于中国科学院微生物研究所，保藏编号AS 1.2437;保藏于日本 微生物菌种保藏中屯、，保藏编号JCM 1149;保藏于美国模式培养物集存库，保藏编号ATCC 14917;德国微生物菌种保藏中屯、，保藏编号DSM 20174;日本发酵研究所，保藏编号IF0 15981。
[0009] 本发明所述植物乳杆菌CICC NO.6240在本发明申请日前可W通过国内外商业渠 道购买，如可向中国工业微生物菌种保藏管理中屯、（加 ina Center of Industrial Culture Collection,CICC)购买该菌株；向美国模式培养物集存库（American type 州hure col lection，ATCC)等机构购买。
[0010]具体的，本发明提供了一种菌制剂，该菌制剂由植物乳杆菌化actobaci 11 us plantar皿 subsp.plantar皿)CICC NO.6240和保护剂组成；
[0011] 所述菌制剂的保护剂为海藻糖、谷氨酸钢、薦糖和脱脂乳粉，W重量百分比计，每 克菌制剂含有海藻糖4~4.1 %、谷氨酸钢2.9~3 %、薦糖10~10.5 %、脱脂乳粉14.5~ 15%;
[0012] 所述菌制剂每克含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum) CICC 6240的活菌数为8 X l〇i2cfu/g~8.1 X l〇i2cfu/g。
[0013] 优选的，W重量百分比计，本发明菌制剂每克含有海藻糖4.04%、谷氨酸钢2.9%、 薦糖10.38%、脱脂乳粉14.84%;每克菌制剂含有植物乳杆菌化actobacillus plantarum subsp. plantarunOCICC NO. 6240的活菌数为8.08 X l〇i2cfu/g;
[0014] 或者，优选的，W重量百分比计，本发明菌制剂每克含有海藻糖4. %、谷氨酸钢 3%、薦糖10%、脱脂乳粉15%，其中每克菌制剂含有植物乳杆菌化日。*〇6日(3111113 plantarum subsp.plantarunOCICC NO.6240的活菌数为8.03Xl〇i2cfu/g。
[0015] 本发明还提供落了上述优选菌制剂的制备方法，包括W下步骤:菌种活化，扩大培 养，离屯、收集菌体，加保护剂，分装，预冻，真空冷冻干燥，从而得到所述发酵剂;其制备步骤 还包括:对保护剂灭困或除困后，再加入困体中。
[0016] 具体的，上述优选菌制剂由W下步骤制备得到：
[0017] (1)取活化的植物乳杆菌(Xactobacillus plantarum subsp.plantarunOCICC 6240，接种到lOmL液体培养基中，37°C下静置培养1她，经两次扩大培养得种子培养液;将种 子培养液W4%的接种量接种增菌培养基中，37°C下静置培养1她；
[0018] (2)将菌液移入无菌离屯、管，W4000转/分钟的转速离屯、lOmin，弃上清液，用质量 体积浓度为0.9%的无菌生理盐水洗涂沉淀菌体后，W4000转/分钟的转速离屯、lOmin，弃上 清液，得乳酸菌菌泥；
[0019] (3)取海藻糖、薦糖和谷氨酸钢，分别溶于蒸馈水，采用膜孔径为0.22WI1的滤菌器 除菌，得海藻糖溶液、薦糖溶液、谷氨酸钢溶液;取脱脂乳粉，溶于蒸馈水，ll〇°C下保溫10分 钟杀菌，得脱脂乳粉溶液；
[0020] (4)将步骤(2)制备得到的菌泥与步骤(3)制备的海藻糖溶液、薦糖溶液、谷氨酸钢 溶液、脱脂乳粉溶液混合，混匀，得菌悬液；
[0021] (5)取步骤(4)制备的菌悬液分装入菌带塞的玻璃瓶中，-70°C下预冻化，在冻干条 件为真空度5Pa、隔板加热溫度20°C、冷阱溫度-55°C的真空冻干机中冻干，冻干时间30h，得 冻干菌制剂。
[0022] 本发明所述的菌制剂，优选为冻干剂，如冻干粉、冻干粉针等。
[0023] 此外，本发明还提供了所述菌制剂作为直投式发酵剂的用途;可用途乳制品等的 发酵。
[0024] W及，本发明所述菌制剂用于制备降低胆固醇产品的用途；
[0025] 同时，本发明还提供了使用所述菌制剂发酵得到的发酵产品，W及该发酵产品制 备降低胆固醇产品的用途;所述发酵产品包括发酵的乳制品。
[0026] 本发明还提供了一种菌制剂的制备方法，该方法包括W下步骤：
[0027] (1)取活化的植物乳杆菌(Xactobacillus plantarum subsp.plantarunOCICC NO. 6240接种到lOmL液体培养基中，37°C下静置培养1她，经两次扩大培养得种子培养液;将 种子培养液W4%的接种量接种增菌培养基中，37°C下静置培养1她；
[00%] (2)将菌液移入无菌离屯、管，W4000转/分钟的转速离屯、lOmin，弃上清液，用质量 体积浓度为0.9%的无菌生理盐水洗涂沉淀菌体后，W4000转/分钟的转速离屯、lOmin，弃上 清液，得乳酸菌菌泥；
[0029] (3)制备保护剂溶液:分别称取海藻糖4.04g、薦糖10.38g、谷氨酸钢2.9g，分别在 40°C下溶于10ml蒸馈水中，吸入5ml注射器，采用膜孔径为0.22皿的滤菌器除菌，将10ml过 滤除菌的海藻糖溶液、薦糖溶液、谷氨酸钢溶液，分别注入90ml无菌水中，得到4.04%海藻 糖溶液，2.9%谷氨酸钢溶液，10.38%薦糖溶液，备用;取脱脂乳粉14.84g，溶于100ml蒸馈 水中，得14.84%脱脂乳粉溶液，110°C灭菌，备用；
[0030] (4)取步骤(2)制备得到的菌泥与步骤(3)制备的海藻糖溶液、薦糖溶液、谷氨酸钢 溶液、脱脂乳粉溶液，将Ig菌泥与5ml海藻糖溶液、5ml薦糖溶液、5ml谷氨酸钢溶液和5ml脱 脂乳粉溶液一起混合，揽拌均匀，得菌悬液；