她，W未接种的培养基为空白对照。将培养液縱满振荡摇匀，吸取 0.5ml菌悬液和4.5ml无水乙醇加入离屯、管中。静置提取lOmin后，300化离屯、15min。取上清 液0.5ml加入洁净试管中，再加入Img/ml邻苯二甲醒液0.2ml、混合酸（1:1浓硫酸、冰乙酸） 4.3ml，制成实验组，对照组用无水乙醇代替离屯、后的上清液，振荡摇匀。静置反应30min后， 在波长550nm处测定吸光度，计算其胆固醇降解率。
[0072] 胆固醇降解率（％) = (C-A)/C*100
[0073] 式中:A为实验菌株培养后的培养液550nm处0D值对应的胆固醇浓度;C为空白对照 的0D值对应的胆固醇浓度;重复试验3次求平均值。
[0074] (2)菌泥降胆固醇能力的测定
[0075] 将实施例一制备的菌泥（即未经冻干的菌泥）W〇. 5%的接种量接种于胆固醇培养 基中，37°C静置培养48h，W未接种的培养基为空白对照。将培养液縱满振荡摇匀，吸取 0.5ml菌悬液和4.5ml无水乙醇加入离屯、管中。静置提取lOmin后，300化离屯、15min。取上清 液0.5ml加入洁净试管中，再加入Img/ml邻苯二甲醒液0.2ml、混合酸（1:1浓硫酸、冰乙酸） 4.3ml，制成实验组，对照组用无水乙醇代替离屯、后的上清液，振荡摇匀。静置反应30min后， 在波长550nm处测定吸光度，计算其胆固醇降解率。
[0076] 胆固醇降解率（％) = (C-A)/C*100
[0077] 式中:A为实验菌株培养后的培养液550nm处0D值对应的胆固醇浓度;C为空白对照 的0D值对应的胆固醇浓度;重复试验3次求平均值。
[0078] (3)实验结果
[0079]
[0080] 经本发明优选的保护剂配方得到的冻干菌制剂5、冻干菌制剂6,其胆固醇降解率 分别为 35.8±1.32、36.2±1.75(%，11 = 3)，与未冻干的菌泥37.3±1.50(%，11 = 3)的胆固 醇降解率相当，没有显著差异，表明本发明优选的保护剂配方得到的冻干菌制剂胆固醇降 解率没有明显变化，冻干对植物乳杆菌14的降胆固醇能力没有明显影响。
[0081] 而其他冻干菌制剂与未冻干的菌泥的降胆固醇能力相比，降胆固醇的能力具有显 著差异，即降低胆固醇的能力显著降低。
[0082] W下为显著性检验分析数据：
[0083] 单一样本统计资料
[00化]单一样本检定
[0084]
[0085]
[0087]
[0088] 使用SPSS软件，对上述降低胆固醇的实验效果进行单样本Τ检验。数据分析显示， 仅冻干菌制剂第5号和冻干菌制剂第6号的Ρ值>0.05,表明冻干菌制剂第5号和冻干菌制剂 第6号与未冻干菌泥降胆固醇效果的差异不显著。其余各组冻干菌制剂的Ρ值均<0.05,表 明与未冻干菌泥降胆固醇效果的差异显著。
【主权项】
1. 一种菌制剂，由植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)CICC NO. 6240和保护剂组成，其特征在于，所述菌制剂每克含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum subsp .plantarum)CICC 6240的活菌数为8 X 1012cfu/g~8 · 1 X 1012cfu/g，所述 保护剂为海藻糖、谷氨酸钠、蔗糖和脱脂乳粉;以重量百分比计，每克菌制剂含有海藻糖4~ 4.1%、谷氨酸钠2.9~3%、蔗糖10~10.5%、脱脂乳粉14.5~15%。2. 根据权利要求1所述的菌制剂，其特征在于，以重量百分比计，所述菌制剂每克含有 海藻糖4.04%、谷氨酸钠2.9%、蔗糖10.38%、脱脂乳粉14.84%，其中每克菌制剂含有植物 乳杆菌（Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)CICC N0.6240的活菌数为8.08X 1012cfu/g； 或以重量百分比计，所述菌制剂每克含有海藻糖4%、谷氨酸钠3%、蔗糖10%、脱脂乳 粉15%，其中每克菌制剂含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum subsp·plantarum) CICC NO · 6240的活菌数为8 · 03 X 1012cfu/g。3. 根据权利要求2所述的菌制剂，其特征在于该菌制剂为冻干剂。4. 一种制备权利要求3所述的菌制剂的方法，其特征在于该方法由以下步骤制备组成： (1) 取活化的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)CICC 6240， 接种到10mL液体培养基中，37°C下静置培养18h，经两次扩大培养得种子培养液;将种子培 养液以4%的接种量接种增菌培养基中，37°C下静置培养18h; (2) 将菌液移入无菌离心管，以4000转/分钟的转速离心1分钟，弃上清液，用质量体积 浓度为0.9%的无菌生理盐水洗涤沉淀菌体后，以4000转/分钟的转速离心10分钟，弃上清 液，得植物乳杆菌菌泥； (3) 取海藻糖、蔗糖和谷氨酸钠，分别溶于蒸馏水，采用膜孔径为0.22μπι的滤菌器除菌， 得海藻糖溶液、蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液;取脱脂乳粉，溶于蒸馏水，ll〇°C下保温10分钟杀 菌，得脱脂乳粉溶液； (4) 将步骤（2)制备得到的菌泥与步骤（3)制备的海藻糖溶液、蔗糖溶液、谷氨酸钠溶 液、脱脂乳粉溶液混合，混匀，得菌悬液； (5) 取步骤(4)制备的菌悬液分装入菌带塞的玻璃瓶中，-70°C下预冻2h，在冻干条件为 真空度5Pa、隔板加热温度20°C、冷阱温度_55°C的真空冻干机中冻干，冻干时间30h，得冻干 菌制剂。5. 据权利要求1-3任一项所述的菌制剂作为直投式发酵剂的用途。6. 根据权利要求1-3任一项所述的菌制剂用于制备降低胆固醇产品的用途。7. -种菌制剂的制备方法，该方法包括以下步骤： (1) 取植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)CICC N0.6240接种 到lOmL液体培养基中，37°C下静置培养18h，经两次扩大培养得种子培养液;将种子培养液 以4%的接种量接种增菌培养基中，37°C下静置培养18h; (2) 将菌液移入无菌离心管，以4000转/分钟的转速离心10min，弃上清液，用质量体积 浓度为〇. 9%的无菌生理盐水洗涤沉淀菌体后，以4000转/分钟的转速离心10min，弃上清 液，得乳酸菌菌泥； (3) 制备保护剂溶液:分别称取海藻糖4.04g、蔗糖10.38g、谷氨酸钠2.9g，在40°C下分 别溶于10ml蒸馏水中，分别吸入5ml注射器，采用膜孔径为0.22μπι的滤菌器除菌，将10ml过 滤除菌的海藻糖溶液、蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液，分别注入90ml无菌水中，得到4.04%海藻 糖溶液，2.9 %谷氨酸钠溶液，10.38 %蔗糖溶液，备用；取脱脂乳粉14.84g，溶于100ml蒸馏 水中，得14.84%脱脂乳粉溶液，110°C灭菌，备用； (4) 取步骤（2)制备得到的菌泥与步骤（3)制备的海藻糖溶液、蔗糖溶液、谷氨酸钠溶 液、脱脂乳粉溶液，按照1 g菌泥：（5ml海藻糖溶液和5ml蔗糖溶液、5ml谷氨酸钠溶液和5ml脱 脂乳粉溶液)的比例进行混合，搅拌均匀，得菌悬液； (5) 取步骤(4)制备的菌悬液分装入菌带塞的玻璃瓶中，-70°C下预冻2h，在冻干条件为 真空度5Pa、隔板加热温度20°C、冷阱温度_55°C的真空冻干机中冻干，冻干时间30h，得冻干 菌制剂。8. -种由权利要求1-3任一项所述菌制剂发酵得到的发酵产品。9. 权利要求8所述的发酵产品制备降低胆固醇产品的用途。
【专利摘要】本发明提供了一种菌制剂，由植物乳杆菌(Lactobacillus？plantarum？subsp.plantarum)CICC？NO.6240I4和保护剂组成，保护剂可有效提高菌制剂冻干剂中植物乳杆菌的存活率。该菌制剂可降低胆固醇，经添加保护剂后的植物乳杆菌冻干剂降低胆固醇的效果，与未经冻干的植物乳杆菌活菌降低胆固醇的效果相当。
【IPC分类】A23C9/123, C12N1/20, C12R1/25
【公开号】CN105543141
【申请号】CN201610023520
【发明人】焦士蓉, 朱奇奇, 张驰翔, 王周, 蒲博
【申请人】西华大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月14日