>[0031] (5)取步骤(4)制备的菌悬液分装入菌带塞的玻璃瓶中，-70°C下预冻化，在冻干条 件为真空度5Pa、隔板加热溫度20°C、冷阱溫度-55°C的真空冻干机中冻干，冻干时间30h，得 冻干菌制剂。其中，步骤(1)所述的接种量是指是指菌液体积与培养基培养液的体积比。
[0032] 本发明菌制剂，优选为冻干菌制剂，由植物乳杆菌化actobacillus plantarum subsp. plantarunOCICC NO. 6240和保护剂组成，所述保护剂组分包括海藻糖、薦糖、谷氨酸 钢和脱脂乳粉。保护剂组成按照本发明特定比例配伍后，有效增强了对植物乳杆菌CICC NO.6240的保护作用，较选用其他保护剂组方成分、或其他配比比例，明显提高了植物乳杆 菌CICC NO. 6240的存活率和降低胆固醇的能力。本发明保护剂组方对植物乳杆菌CICC NO.6240的保护作用，具有协同增效的作用，有效提高了经冻干工艺所得冻干菌制剂的活菌 存活率，并维持了冻干菌制剂降胆固醇的活性，使植物乳杆菌CICC NO.6240冻干后降胆固 醇的效果与植物乳杆菌CICC NO.6240冻干前降低胆固醇的效果相当。
[0033] 本发明提供了一种植物乳杆菌CICC NO.6240的专属冻干保护剂配方，该保护剂配 方各组分按本发明的特定比例配伍，协同增效的增强了对植物乳杆菌CICC NO.6240存活率 和活性的保护效力，有效避免了冻干过程对菌株存活率的降低作用，使并维持了冻干菌制 剂降胆固醇的活性，使植物乳杆菌冻干后降低胆固醇的效果与冻干前降低胆固醇的效果相 当，在提高冻干粉中菌株活性的同时大大降低了发生产成本。
[0034] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想的前提下，还可W做出其他多种形式的修改、替换或者变更。
[0035] W下W实施例形式的具体实施方法，对本发明的上述内容在做进一步的详细说 明，但不应理解为下述实施例用于限定本发明的保护范围。
[0036] 具体实施方法
[0037] 1、本发明实验仪器和实验材料。
[003引1.1实验仪器
[0039] UV-2600A型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；自动台式灭菌锅 (山东新华医疗器械股份有限公司）；微孔过滤器及滤膜(0.22μπ0;化to Lyolab 3000冻干 机(上海汇分电子科技有限公司）
[0040] 1.2实验材料
[0041] 薦糖(成都市科龙化工试剂厂）；海藻糖(河南豫兴生物科技有限公司）；脱脂乳粉 (郑州市伟丰生物科技有限公司）；谷氨酸钢(河南凯成化工产品有限公司）；甘露醇(上海陆 安生物科技有限公司）；菌种:植物乳杆菌CICC NO.6240,保藏于位于北京市朝阳区酒仙桥 中路24号院6号楼的中国工业微生物菌种保藏管理中屯、（China Center of Industrial Culture Collection,CICC)〇
[0042] 实施例一、植物乳杆菌CICC NO.6240菌泥的制备
[0043] (1)菌体的富集培养
[0044] 取植物乳杆菌CICC NO.6240菌粉，接种到10ml本领域常规的液体培养基中活化， 37°C下静置培养18h，经两次活化培养得种子培养液。将种子液W4%的接种量接种到100ml 增菌培养基中，37°C下静置培养1她。接种量指种子培养液与培养基的体积比。
[0045] (2)菌体的收集
[0046] 当发酵进行至对数期后期，将菌液移入无菌离屯、管中，，4000r/min离屯、lOmin，弃 上清液，用无菌0.9 %生理盐水洗涂沉淀菌体，再W同样的条件离屯、lOmin，弃上清液即得植 物乳杆菌CICC NO.6240菌泥。
[0047] 将菌泥/菌泥混悬液平均分为10份。
[0048] 实施例二、冻干菌制剂的制备
[0049] (1)首先，配制保护剂各组分的溶液。按照表一记载的保护剂配方和比例，分别取 海藻糖、谷氨酸钢、薦糖，甘露醇，W蒸馈水为溶剂制备溶液，采用膜孔径为〇.22μπι的滤菌器 除菌，分装在灭菌的带塞玻璃瓶中，经培养检验确认无菌后冷藏备用，可根据需要进一步稀 释;按照表一记载的保护剂配方和比例，取脱脂乳粉，溶解于蒸馈水中，ll〇°C下保溫lOmin 杀菌，备用。
[0050] 例如，配制表一中保护剂配方编号6的各保护剂成分的特定浓度的溶液:分别称取 海藻糖4.04g、薦糖10.38g、谷氨酸钢2.9g，分别在40°C下溶于10ml蒸馈水中，吸入5ml注射 器，采用膜孔径为0.22WI1的滤菌器除菌，将10ml过滤除菌的海藻糖溶液、薦糖溶液、谷氨酸 钢溶液，分别注入90ml无菌水中，得到4.04%海藻糖溶液，2.9%谷氨酸钢溶液，10.38%薦 糖溶液，备用；取脱脂乳粉14.84g，溶于蒸馈水中，得14.84%脱脂乳粉溶液100ml，110°C灭 菌，备用。其他编号的保护剂配方，在替换相应的投料量后，可参照类似方法配制溶液。
[0051] (2)配制菌悬液，制备冻干制剂。分别按照下表一保护剂配方中的组别编号和保护 剂具体组分及其浓度配制保护剂溶液，备用;分别取实施例一制备的菌泥9份，按照菌泥质 量与配方中各种保护剂溶液体积之比为1:5的比例，将菌泥与各保护剂溶液混合，得菌悬液 9份。例如，W表一中保护剂配方编号6制备菌悬液，即按照保护剂配方6规定的保护剂浓度， 按Ig菌泥：（5ml海藻糖溶液巧ml薦糖溶液巧ml谷氨酸钢溶液巧ml脱脂乳粉溶液）的比例，将 保护剂溶液添加至菌泥中，混合混匀，配制需要的菌悬液。
[0052] 分别从9份菌悬液中取5mL菌悬液分装入lOmL无菌带塞的玻璃瓶中，放在-70°C下 预冻，2h后取出在真空冻干机中冻干，冻干条件为真空度5Pa、隔板加热溫度20°C、冷阱溫 度-55°C，冻干时间约30h，分别得冻干菌制剂9份。
[0053] 添加保护剂配方1、保护剂配方2、保护剂配方3、保护剂配方4、保护剂配方5、保护 剂配方6、复方保护剂配方7、保护剂配方8、保护剂配方9后制备得到的冻干剂，分别对应冻 干菌制剂1、冻干菌制剂2、冻干菌制剂3、冻干菌制剂4、冻干菌制剂5、冻干菌制剂6、冻干菌 制剂7、冻干菌制剂8、冻干菌制剂9。
[0054] 表一:保护剂配方(浓度单位:w/v即质量体积浓度:g/ml)
[0化5]
[0化6] W下为实验例：
[0057] 实验例一菌泥活菌测定
[0058] 取实施例一制备的菌泥1份，测定活菌含量。采用梯度稀释平板计数法，即在无菌 操作条件下，吸取充分混匀的样液〇.5mL，加入灭菌生理盐水中，制成1:10的均匀稀释液，再 依次进行10倍递增稀释，至1:10"。吸取0.5mL置于灭菌培养皿中，再倒入45°C左右的MRS琼 脂计数培养基约15mL，混匀。待其凝固后，于37°C恒溫培养箱中倒置培养36h，用菌落计数器 计数，得菌泥的活菌含量为9.7X l〇i2c化/邑。
[0059] 实验例二
[0060] (1)冻干制剂活菌测定
[0061] 取实施例二制备的冻干菌制剂1-9,分别用5mL灭菌的PBS缓冲液复水，然后采用梯 度稀释平板计数法，即在无菌操作条件下，吸取充分混匀的样液0.5mL，加入灭菌生理盐水 中，制成1:10的均匀稀释液，再依次进行10倍递增稀释，至1:1012。吸取0.5mL置于灭菌培养 皿中，再倒入45°C左右的MRS琼脂计数培养基约15mL，混匀。待其凝固后，于37°C恒溫培养箱 中倒置培养36h，用菌落计数器计数。
[0062] (2)计算方法
[0063]
[0064] 其中，"冻干前1ml菌悬液的活菌数X菌悬液体积"，即1份菌悬液中的活菌数，相当 于添加保护剂之前的1份菌泥中的活菌数，与实验例一测定的1份菌泥的活菌数相当。
[0065] (3)计算结果
[0068] 实验数据显示，冻干菌制剂5、冻干菌制剂6具有最高的植物乳杆菌CICC NO.6240 存活率，较其他保护剂配方的冻干菌制剂，显著提高了植物乳杆菌CICC NO. 6240的存活率。
[0069] 实验例二、菌制剂降胆固醇能力测试
[0070] (1)冻干后菌制剂降胆固醇能力的测定
[0071] 分别将实施例二制备的冻干菌制剂菌粉，W0.5%的接种量(w:v)接种于胆固醇培 养基中，37°C静置培养4