us-20离必超滤装置（Millipore)纯化和浓缩慢 病毒，步骤如下；（1) 4°C，4000g离必lOmin，除去细胞碎片；似0. 45 μ m滤器过滤上清液于 40ml超速离必管中，将病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多19ml)，盖上盖子，将过滤杯 插到滤过液收集管中；（3)合好后，做好平衡，放在转头上，4000g离必，10-15min，至需要的 病毒浓缩体积；(4)离必结束后，取出离必装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将 过滤杯倒扣在样品收集杯上，离必2min离必力不超过lOOOg ; (5)把离必杯从样品收集杯 上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒 浓缩液中含有的siRNA的第一链的序列如SEQ ID NO: 13所示。对照慢病毒的包装过程同 GTPBP4-S i RNA 慢病毒，仅 W pGCS 比-GFP-Scr-s i RNA 载体代替 pGCS I kGFP-GTPBP4-s i RNA 载 体。
[0105] 实施例2实时英光定量RT-PCR法检测GTPBP4基因的沉默效率
[0106] 处于对数生长期的结肠癌服0细胞进行膜酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为 5XloVml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复数（M0I，服0:10) 值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到4天后，收 集细胞。根据Invitrogen公司的化izol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的 M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见表7,42°C反应比）然后在 7(TC水浴锅中水浴lOmin使逆转录酶失活。
[0107] 采用TP800型Real time PCR仪灯AKARA)进行实时定量检测。GTPBP4基 因的引物如下：上游引物5' -TCCCAGGAGTGTCTACAACCT-3' (SEQ ID NO ; 13)和下游引 物 5' -CAGCCCTATGCGTTCACAAC-3'（SEQ ID NO ;14)。W 管家基因 GAPDH 为内参，引 物序列如下：上游引物5' -TGACTTCAACAGCGACACCCA-3 '（沈Q ID NO ; 15)和下游引物 5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3,（沈Q ID N0;16)。按表 8 中的比例配置反应体系。
[0108] 表7逆转录反应体系
[0109]
[0110] 表 8 Real-time PCR 反应体系
[0111]
[0112] 设定程序为两步法Real-time PCR ;预变性95°C，15s ;之后每一步变性95°C，5s ; 退火延伸6(TC，30s;共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95°C变 性Imin，然后冷却至55°C，使DNA双链充分结合。从55°C开始到95°C，每一步增加0. 5°C， 保持4s，同时读取吸光值，制作烙解曲线。采用2-ΑΑα分析法计算侵染了 GTPBP4mRNA的表 达丰度。侵染对照病毒化v-Scr-siRNA)的细胞作为对照。实验结果（图2)表明，结肠癌 服ο细胞中GTPBP4mRNA的表达水平下调了 79. 2%。
[0113] 实施例3检测侵染了 GTPBP4-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力
[0114] 处于对数生长期的结肠癌服0细胞进行膜酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为 5 X lOVml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30 %。根据侵染复数（M0I，服0 ; 10)， 加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到4天后，收集处于对数生长期 的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液（2 X lOYml)，W细胞密度约为2000个/孔， 接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μ 1。铺好板后，置37°C、5% %培养箱培养。从铺 板后第二天开始，每天用Cellomics ArrayScan VTI高内涵筛选分析仪（Thermo Fisher) 检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地 计算出每次扫描孔板中的带绿色英光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖 曲线（结果如图3所示）。结果表明，慢病毒侵染组结肠癌RK0细胞体外培养5天后，增殖 速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度，活力细胞数目分别下降了 83. 1%，表明 GTPBP4基因沉默导致肿瘤细胞增殖能力被抑制。
[0115] W上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制， 应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可W做出 若干改进和补充，送些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用W上所掲示的技术内容而做出的些许更 动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对 上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围 内。
【主权项】
1. 一种分离的人GTPBP4基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物 中的用途。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自结肠癌。3. -种降低肿瘤细胞中GTPBP4基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含： a) 双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与GTPBP4基因杂交的核苷酸序 列；或者 b) shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与GTPBP4基因杂交的核苷酸序列。4. 如权利要求3所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA包含第一链和第二 链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与GTPBP4 基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义 链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所 述正义链片段的序列与GTPBP4基因中的靶序列基本相同。5. 如权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述GTPBP4基因的靶序列含 有SEQ ID NO: 1-5中任一序列。6. 如权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA为小干扰RNA， 该小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO :17所示。7. 如权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQ ID NO :18所示。8. -种GTPBP4基因干扰核酸构建体，含有编码权利要求3-7任一权利要求所述分离的 核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。9. 如权利要求8所述GTPBP4基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述GTPBP4基因干扰 核酸构建体为干扰慢病毒载体。10. 如权利要求9所述GTPBP4基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述干扰慢病毒载体 由将编码所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，所述慢病毒载体选自： pLKO. l-puro、pLK0. l-CMV-tGFP、pLKO.l-pur〇-CMV-tGFP、pLKO. 1-CMV-Neo、 pLKO. l-Neo、pLK0. l-Ne〇-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、 pLKO. l-pur〇-CMV-TagYFP、pLKO. l-pur〇-CMV-TagRFP、pLKO.l-pur〇-CMV-TagFP635、 pLKO.l-pur〇-UbC-TurboGFP> pLKO. l-pur〇-UbC-TagFP635> pLK〇-pur〇-IPTG-lxLacO> pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5-GW/lacZ、 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-GW/lacZ 中的任 o11. 一种GTPBP4基因干扰慢病毒，由权利要求9-10任一权利要求所述干扰慢病毒载体 在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。12. -种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含有权利要求3-7任一权利 要求所述的分离的核酸分子，权利要求8-10任一权利要求所述GTPBP4基因干扰核酸构建 体，和/或权利要求11所述的GTPBP4基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂 或赋形剂。13. 权利要求12所述药物组合物在制备治疗结肠癌的肿瘤治疗药物中的应用。14. 一种用于降低肿瘤细胞中GTPBP4基因表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包 括：存在于容器中的，权利要求3-7任一权利要求所述的分离的核酸分子，权利要求8-10任 一权利要求所述GTPBP4基因干扰核酸构建体，和/或权利要求11所述的GTPBP4基因干扰 慢病毒。
【专利摘要】本发明公开了人GTPBP4基因的用途及其相关药物。本发明公开了人GTPBP4基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本发明还进一步构建了人GTPBP4基因小分子干扰RNA、人GTPBP4基因干扰核酸构建体、人GTPBP4基因干扰慢病毒并公开了它们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人GTPBP4基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中GTPBP4基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
【IPC分类】C12N15/113, C12Q1/68, C12N7/01, A61P35/00, C12N15/867, A61K31/713
【公开号】CN105586391
【申请号】CN201410636065
【发明人】朱向莹, 王小霞, 沈克, 吴涛, 金杨晟, 曹跃琼
【申请人】上海吉凯基因化学技术有限公司
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2014年11月12日