酸乙酯的小鼠口服急性毒性评估
[0064] 选取Balb/c小鼠（购于大连医科大学实验动物中心），雌雄各半，体重19_22g。 将小鼠随机分组，每组20只，雌雄各半。测试化合物混悬于0. 5% CMC-Na中，浓度为lg/L。 实验组包括测试化合物不同剂量组（0. 1~lg/kg)以及0. 5% CMC-Na空白对照组。连续观 察给药后小鼠的行为状态直至14天，并于第14天对不同给药组小鼠进行大体解剖并观察 内脏情况。最大剂量组（lg/kg)给药组小鼠中只有4例死亡，其他剂量组均无死亡例。对 死亡个体进行解剖并未发现肝、肾等主要器官的明显病变。实验结果表明小鼠口服（3-羧 丙酰基）-11-脱氧-甘草次酸-29-羧酸乙酯的LD50值大于1. Og/kg，提示该新型羧酸酯酶 抑制剂具有良好的安全性。
[0065] 实施例5.
[0066] (3-羧丙酰基）-11-脱氧-甘草次酸-30-羧酸乙酯对减缓高脂饮食诱发大鼠营养 性肥胖的研究
[0067] 选取45只成年SD雄性大鼠，采用D12492配方所制作的高脂肪、高热量食物进行 限制饲喂，第1周内每只鼠13g，以后每周增加2g，至第6周为止。每日饲养分2次供给， 吃完后不再添加，自由饮水。于3周后将体重增加排在后1/3的大鼠作为肥胖抵抗大鼠剔 除。其余大鼠按照随机分组原则分为正常饲料组、高脂饮食模型组和（3-羧丙酰基）-11_脱 氧-甘草次酸-30-羧酸乙酯给药组（以下简称脱氧甘草次酸组），每组10只大鼠。正常 饲料组只给于正常饲料、高脂饮食组继续给予高脂饮食，而脱氧甘草次酸组于按300 mg/ kg(每日，三次）剂量口服灌胃给予（3-羧丙酰基）-11-脱氧-甘草次酸-30-羧酸乙酯。 连续操作4周（即第4-7实验周），并分别对体重和Lee' s指数（麻醉后测量大鼠从鼻至 肛门的长度，并根据公式[Lee' s指数=体重（g) 1/3X103/体长（cm)]计算Lee' s指数） 进行观察。
[0068] 表2.大鼠体重及Lee' s指数观察
[0070] 实验结果证实，给予大鼠（3-羧丙酰基）_11_脱氧-甘草次酸-30-羧酸乙酯能 够有效缓解高脂饮食导致的大鼠体重过度增长，提示其可能通过抑制肠道中高表达的CES2 而对脂质化合物体内平衡进行调节，抑制肥胖的发生。
[0071] 实施例6.
[0072] (3-羧丙酰基）-11-脱氧-甘草次酸-30-羧酸乙酯对减缓伊立替康导致的小鼠腹 泻研究
[0073] 18只Balb/c小鼠随机分为3组：正常对照组、伊立替康腹泻模型组和（3-羧丙 酰基）-11-脱氧-甘草次酸-30-羧酸乙酯+伊立替康腹泻模型组（以下简称脱氧甘草次 酸组），每组各6只。分别观察正常对照组、腹泻模型组和脱氧甘草次酸组小鼠的腹泻状 况，并对小鼠肠道组织进行组织切片检查。腹泻模型组按Trifan方法（Cancer Res 2002; 62:5778-84.)，腹泻模型采用腹腔注射伊立替康（100mg/kg/d)，连续用药3天（d)，迟发性 腹泻于第3天出现，于第4天最严重。脱氧甘草次酸组于CPT-11注射前3天开始，每天1 次，灌胃l〇〇mg/kg，其余两组用等体积蒸馏水灌胃来防止应急对小鼠造成的影响。正常对照 组尾静脉注射等体积生理盐水。分别观察正常对照组、腹泻模型组和脱氧甘草次酸组小鼠 的腹泻状况，于第7天处死小鼠，进行肠道组织取材，组织切片染色检查。
[0074] 注射CPT-11后第9天处死小鼠，距回盲瓣5cm处取回肠3cm、盲肠1cm、肛门至上 7~9cm取结肠组织3cm，10%甲醛固定，以备光镜观察。常规HE染色观察各组小鼠肠粘膜 组织结构变化；根据Chiu肠粘膜损伤评分方法（Arch Surg 1970; 101:478-83)，对肠粘膜 损伤程度进行分级级：正常肠粘膜绒毛；2级：上皮下间隙扩大，通常在肠绒毛顶端，常 有上皮充血；3级：上皮下间隙扩张，伴有中等程度上皮层从肠粘膜固有层脱离；4级：肠粘 膜侧面大块上皮脱离，大部分肠绒毛顶端变光滑；5级：肠绒毛变光滑，毛细血管扩张，肠粘 膜固有层细胞构成增加；6级：肠粘膜固有层消化和分解，出血和出现溃疡。
[0075] 对肠粘膜损伤程度进行评估如表3所示，实验结果显示，腹泻程度显著下降，脱 氧甘草次酸组肠粘膜损坏程度较模型组轻微。以上实验结果证实，（3-羧丙酰基）-11_脱 氧-甘草次酸-30-羧酸乙酯不仅能够降低CPT-11诱发的小鼠迟发性腹泻及肠粘膜损伤的 程度，还能较好地抑制腹泻的发生。因此，（3-羧丙酰基）-11_脱氧-甘草次酸-30-羧酸 酯对CPT-11诱发的小鼠迟发性腹泻具有一定的预防作用。
[0076] 表3?小鼠盲肠肠粘膜损伤程度分级n(% )
【主权项】
1. 一种五环三萜类化合物，其特征在于：该化合物为11-脱氧-甘草次酸-3-0-琥珀 酰衍生物的羧酸酯，其结构式如下：其中，R为甲基、乙基、丙基中的任意一种。2. -种如权利要求1所述的五环三萜类化合物制备方法，其特征在于该化合物的合成 按照以下步骤进行： 1) 采用锌粉-盐酸还原体系，高选择性地脱除甘草次酸11位羰基；获得11-脱氧-甘 草次酸； 2) 以卤代烷（碘甲烷、溴乙烷、溴丙烷）为酯化试剂，缚酸剂可为碳酸钾、碳酸钠，实现 了 30位羧基的选择性酯化，获得18 β -11-脱氧-甘草次酸-30-酯； 3) 以琥珀酸酐为酯化试剂，4-二甲氨基吡啶为高效的反应促进剂，高效地在3位引入 琥珀酸，得到产物18 β -(3-羧丙酰基）-11-脱氧-甘草次酸-30-酯。3. 按照权利要求2所述的五环三萜类化合物制备方法，其特征在于所述步骤 (3) 18 β -(3-羧丙酰基）-11-脱氧-甘草次酸-30-酯的制备方法具体如下： 室温下，依次将18 β -11-脱氧-甘草次酸-30-酯、4-二甲氨基吡啶、琥珀酸酐加入到 二氯甲烷溶液中，加完室温反应，薄板层析（TLC)监测反应；反应完全后，加水，1Μ HC1溶液 调pH = 2-3,乙酸乙酯萃取三次，合并有机相水洗、饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸钠干燥，蒸 除溶剂，粗产物柱层析得产物18 β - (3-羧丙酰基）-11-脱氧-甘草次酸-30-酯3 ; 各反应试剂的用量按摩尔比为18 β -11-脱氧-甘草次酸-30-酯：琥珀酸酐：4_二甲 氨基吡啶=1. 0:1. 5-3. 0:1. 5-3. 0。4. 一种五环三萜类化合物作为人肠羧酸酯酶抑制剂的应用，其特征在于：该化合物作 为一种人肠道羧酸酯酶的强效抑制剂，可强效地、选择性地抑制人羧酸酯酶亚型2的活性， 其抑制人羧酸酯酶1的IC 5。与抑制人羧酸酯酶2的1C 5。比率可达1020倍。5. 按照权利要求4所述的五环三萜类化合物作为人肠羧酸酯酶抑制剂的应用，其特征 在于可制备含五环三萜类化合物的药物，该药物可通过强效抑制人肠道羧酸酯酶提高口服 酯类前药的生物利用度，进而发挥酯类前药增效剂的功效。6. 按照权利要求4所述的五环三萜类化合物作为人肠羧酸酯酶抑制剂的应用，其特征 在于可制备含五环三萜类化合物的药物，该药物可通过强效抑制人肠道羧酸酯酶减缓脂肪 酸类物质的肠道吸收，进而用于肥胖、糖尿病等代谢紊乱性疾病的辅助治疗。7. 按照权利要求4所述的五环三萜类化合物作为人肠羧酸酯酶抑制剂的应用，其特征 在于可制备含五环三萜类化合物的药物，该药物可通过强效抑制人肠道羧酸酯酶，进而可 以缓解临床多种化疗药物导致的迟发型腹泻等副作用。
【专利摘要】本发明提供了一种五环三萜类化合物及其作为人肠羧酸酯酶抑制剂的应用，属生物医药技术领域。该五环三萜类化合物具有11-脱氧-甘草次酸骨架结构，其可以强效地、选择性地抑制人肠道羧酸酯酶亚型2的活性，进而提高口服前药的生物利用度，并减少肠道酯类物质的摄取。此外，该抑制剂还可减缓伊立替康引发的迟发型腹泻。体外活性测定发现该类化合物抑制人羧酸酯酶2的IC50可达0.02微摩，抑制人羧酸酯酶1的IC50与抑制人羧酸酯酶2的IC50比率可达1020，且该类化合物的安全性较好，同时还具有制备工艺简单、收率高等优势，提示该类化合物显示具有良好的应用前景。
【IPC分类】C07J63/00, A61P1/12, A61P3/10, A61K31/56, A61P3/04
【公开号】CN105713064
【申请号】CN201410742503
【发明人】杨凌, 邹立伟, 葛广波, 李耀光, 宁静, 王平
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2014年12月5日
【公告号】WO2016086496A1