高效液相色谱法检测AL58805原料药或药物制剂中基因毒性杂质的方法与流程

本发明涉及一种al58805原料药或药物制剂中基因毒性杂质的分析方法，特别涉及一种采用高效液相色谱法对al58805中基因毒性杂质对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯进行分离和定量测定的方法。

背景技术：

al58805是由南京爱德程医药科技有限公司研发的一类新药，是在通过计算机辅助药物设计技术筛选得到的一种新型pi3k/mtor双靶点激酶抑制剂，且具有完全自主知识产权。前期的研究结果表明，al58805是一种优秀的抗肿瘤药物，作用靶点独特，抗肿瘤作用明显，毒副作用小，其在胃癌、肾癌、骨肉瘤、结肠癌裸小鼠移植瘤模型中已被证实有明显的抗肿瘤活性，因此，开发成新药后将在临床治疗肿瘤中具有独特的优势。

基因毒性杂质：在以dna反应物质为主要研究对象的体内/体外试验中，发现它们对dna有潜在的破坏性。按照目前的法规来说，(体内)基因毒性物质在任何摄入量水平上对dna都有潜在的破坏性，这种破坏可能导致肿瘤的产生，所以必须严格控制。

对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯是合成al58805原料药时产生的副产物，属于潜在基因毒性杂质。为了严格控制对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的含量，需寻求一种简单、快捷、专属性强、灵敏度高的分析方法显得犹为重要。

关于al58805中对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯含量测定的方法在国内外还没有报道。现今，仅有关于其它药物中对甲苯磺酸酯类基因毒杂质测定的文献报道，报道中常用的检测方法是高效液相色谱法、液质联用法，如长春西汀中对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的lc-ms/ms法测定^[1]、lc-ms/ms测定草酸右旋西酞普兰中对甲苯磺酸酯类基因毒性杂质的含量^[2]、hplc法测定氢溴酸西酞普兰中的基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯^[3]。文献^[1]和文献^[2]基因毒性杂质的线性范围及定量限浓度均相似，文献^[1]中对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的定量限均为2.5ng/ml(2.5ppm)，线性范围为2.5～50ng/ml，文献^[3]中对甲苯磺酸乙酯的定量限为25.6ng/ml(5.12ppm)，线性范围为25.6～187.5ng/ml。而且，虽然质谱检测器是一种高灵敏度的通用检测器，然而高昂的价格限制了它的推广使用。

[1]张薇，陈夷花，郑枫.长春西汀中对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的lc-ms/ms法测定[j]，中国医药工业杂志，2015，46(12)：1334-1336.

[2]梁键谋，傅聪，陈悦.lc-ms/ms测定草酸右旋西酞普兰中对甲苯磺酸酯类基因毒性杂质的含量[j]，中国现代应用药学，2016，33(11)：1436-1440.

[3]孙朴.hplc法测定氢溴酸西酞普兰中的基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯[j]，药学研究，2015，34(11)：637-639.

技术实现要素：

针对现有技术中存在的缺点与不足，本发明的目的是提供一种高效液相色谱法检测al58805原料药或药物制剂中基因毒性杂质(对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯)的方法。

通过高效液相色谱对样品前处理、色谱柱、流动相等条件反复筛选，探索出了合适的分析条件。为兼顾主成分与杂质的分离要求，选择了合适的缓冲溶液体系、流动相的比例等关键检测条件；为减少供试品溶液对杂质测定的干扰，对样品前处理中供试品浓度、ph值、析晶温度、静置时间、过滤方式等进行了筛选，最终确立的方法达到了上述发明目的。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明采用高效液相色谱法对al58805原料药或包含al58805的药物制剂中基因毒性杂质对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯定量分析的方法，该方法的具体步骤如下：

(1)标准工作溶液的配制

分别称取对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的储备溶液，后用乙腈-水(50:50v/v)逐步稀释制成每1ml中约含对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯各5、30、60、100、150、200ng的溶液作为标准工作液。

(2)样品前处理

取al58805供试品适量(约相当于al58805100mg)，置10ml量瓶中，加适量乙腈-水(50:50v/v)溶解后，用1mol/l氢氧化钠溶液调节ph至8.5～9.5，加乙腈-水(50:50v/v)稀释至刻度，摇匀，超声10分钟，于0℃析晶30分钟后，取出强力振摇，静置0.5～1.5小时后，用微孔滤膜过滤，取滤液测定。

优选地，样品前处理中：用1mol/l氢氧化钠溶液调节ph至9，静置时间为1小时，用0.45μm微孔滤膜过滤。

(3)液相色谱检测条件

流动相：乙腈-磷酸水溶液；流速：0.8～1.2ml/min；柱温：30～40℃；检测波长：225nm；进样量：20μl；十八烷基键合硅胶色谱柱(c18色谱柱)，洗脱时间为18min；检测器为紫外检测器。

进一步地，所述流动相乙腈-磷酸水溶液的体积比为50:50。

进一步地，所述磷酸水溶液的浓度为5mmol/l-50mmol/l，优选为15mmol/l。

进一步地，所述流速为0.8～1.2ml/min，优选为1.0ml/min。

进一步地，所述柱温为30～40℃，优选为35℃。

进一步地，所述c18色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm。

(4)取步骤(1)中对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯标准储备液适量，用乙腈-水(50:50v/v)逐步稀释成每1ml中约含对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯各100ng的溶液作为对照品溶液；精密称取al58805供试品适量(约相当于al58805100mg)，置10ml量瓶中，按步骤(2)的方法前处理作为供试品溶液。精密量取对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积计算，6次进样的相对标准偏差不得大于2.0％；再精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积按下式计算，计算公式：

式中：as：对照品溶液中杂质的平均峰面积；cs：对照品溶液中杂质的浓度(ng/ml)；at：供试品溶液中杂质的峰面积；ct：供试品溶液的浓度(mg/ml)。

本发明对采用高效液相色谱法检测al58805中的基因毒性杂质对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯含量的色谱条件进行了优化，取得了最佳色谱条件，然后针对此条件进行对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯含量测定方法学验证。

本发明采用高效液相色谱法建立了al58805中对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯含量检测的方法，样品采用乙腈-水(50:50v/v)溶解后，通过调节供试品ph值使其析晶，从而降低供试品浓度，减少对基因毒性杂质测定干扰的方法，本发明方法的效果和优点是：

1、本发明可有效分离出al58805与基因毒性杂质(对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯)，空白稀释液不干扰基因杂质的检测，方法专属性强，十分快速。

2、本发明能对基因毒性杂质对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯进行定量，且有较高的灵敏度，对甲苯磺酸甲酯检测限为0.3ppm，定量限为1ppm；对甲苯磺酸乙酯检测限为0.5ppm，定量限为1.4ppm，灵敏度高于参考文献^[1]中lc-ms/ms法。

3、本发明检测方法检测成本低廉、经济实用、专属性强、简单快捷、灵敏度高，可用于al58805及含有al58805的药物制剂中潜在基因毒性杂质的质量控制。

4、本发明方法经过方法学验证，结果均符合要求，证明本发明可用于al58805中基因毒性杂质对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的含量检测。

5、本发明与其它药物中对甲苯磺酸酯类基因毒杂质检测方法相比，增加了样品前处理步骤(溶解、析晶、过滤等)，从而大大降低了进样溶液中供试品浓度，减少高浓度供试品溶液对杂质测定的干扰和对色谱柱的伤害，并使得实验结果更加准确。

附图说明

图1最佳色谱条件下对甲苯磺酸甲酯(mpts)、对甲苯磺酸乙酯(epts)的色谱图；

图2最佳色谱条件下al58805中添加对甲苯磺酸甲酯(mpts)、对甲苯磺酸乙酯(epts)的色谱图；

图3为基因毒性杂质的标准曲线图：(a)对甲苯磺酸甲酯的标准曲线；(b)对甲苯磺酸乙酯的标准曲线；

图4室温条件下对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的稳定性示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1：

一、标准储备液的制备

分别精密称取对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液作为标准储备溶液，后用乙腈-水(50:50v/v)逐步稀释成所需的浓度。

二、液相色谱条件

色谱柱为inertsustainc18(4.6×250mm,5μm)；流动相为15mmol/l磷酸水溶液-乙腈

(50:50v/v)；检测波长为225nm；流速为1ml/min；柱温为35℃；进样量20μl；洗脱时间为18min。

三、样品前处理方法

取al58805供试品约100mg，置10ml量瓶中，加适量乙腈-水(50:50v/v)溶解后，用1mol/l氢氧化钠溶液调节ph至9，加乙腈-水(50:50v/v)稀释至刻度，摇匀，超声10分钟，于0℃析晶30分钟后，取出强力振摇，静置1小时后，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液测定。

四、方法学的验证

专属性考察：空白稀释液不干扰对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的检测，专属性良好。

检测限定量限考察：在本试验条件下，配制不同浓度的对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯对照品，检测限以s/n≥3计，定量限以s/n≥10计，分别进样确定对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的检测限和定量限，实验结果见下表1。

表1

对照品溶液稳定性考察：取对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯混合对照品溶液(100ng/ml)，进行溶液稳定性试验，分别测定放置0、3、7、10、17、24小时后的峰面积。测定结果见下表2。

表2

对照品溶液室温放置24小时，对甲苯磺酸甲酯的峰面积平均值为6.96，rsd为3.8％；对甲苯磺酸乙酯的峰面积平均值为6.46，rsd为3.7％，表明对照品溶液室温放置24小时内稳定。

线性考察：取标准储备溶液适量，用乙腈-水(50:50v/v)稀释制成下列标准系列混合溶液。精密量取标准系列混合溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，具体如表3和图3所示。

表3

对甲苯磺酸甲酯线性回归方程为y＝0.0638x+0.0004，回归系数r为0.9999，说明本品在3.320ng/ml～199.2ng/ml范围内线性良好；对甲苯磺酸乙酯线性回归方程为y＝0.0623x-0.0444，回归系数r为0.9997，说明本品在4.550ng/ml～202.0ng/ml范围内线性良好。

准确度：称取al58805供试品适量(约相当于al58805100mg)，置10ml量瓶中，作为回收率基质样品；分别精密量取对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯标准储备溶液0.1ml置10ml量瓶中，用乙腈-水(50:50v/v)稀释制成每1ml中约含10μg的混合溶液作为杂质溶液。以基因杂质的含量(0.001％基质样品浓度)为基准100％，精密量取杂质溶液0.07ml、0.10ml、0.13ml分别置于盛有基质样品的10ml量瓶中，混匀，用乙腈-水(50:50v/v)定容，配制成含杂质70％、100％、130％的溶液，同法平行3次，作为供试品溶液。具体配制方法见下表4。

表4

精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪中，记录色谱图，量取峰面积(其中供试品中对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的峰面积需扣除样品基质中对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的峰面积)，计算回收率，实验结果见下表5和表6。

回收率计算公式：

实际回收量＝au×fs×cs

式中：ws：杂质对照品的质量(mg)；cs：杂质对照品的含量(％)；au：供试品溶液中杂质的峰面积(扣除基质中杂质峰面积)；fs：杂质浓度与峰面积比。

表5

表6

从上述系列表可以看出，对甲苯磺酸甲酯测定平均回收率为92.1％，rsd为2.8％(n＝9)，对甲苯磺酸乙酯测定平均回收率为101.4％，rsd为2.7％(n＝9)，表明该方法检测对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的准确度良好。

实施例2：

1、标准储备液的制备与实施例1相同；

2、液相色谱条件中：流动相为5mmol/l磷酸水溶液-乙腈(50:50v/v)；其余与实施例1相同。

3、样品前处理：与实施例1相同。

4、方法学验证和实施例1相同，结果表明，对甲苯磺酸甲酯平均回收率(药典中标准为80-115％)为89.0％，rsd为1.6％，对甲苯磺酸乙酯平均回收率(药典中标准为80-115％)为101.7％，rsd为2.3％，该方法检测对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的准确度良好。

实施例3：

1、标准储备液的制备与实施例1相同；

2、液相色谱条件中流动相为50mmol/l磷酸水溶液-乙腈(50:50v/v)；其余与实施例1相同。

3、样品前处理：与实施例1相同。

4、方法学验证和实施例1相同，结果表明，对甲苯磺酸甲酯平均回收率为93.1％，rsd为1.7％，对甲苯磺酸乙酯平均回收率为102.1％，rsd为2.7％，该方法检测对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的准确度良好。

实施例4：

1、标准储备液的制备与实施例1相同；

2、液相色谱条件中流动相为30mmol/l磷酸水溶液-乙腈(50:50v/v)；其余与实施例1相同。

3、样品前处理：与实施例1相同。

4、方法学验证和实施例1相同，结果表明，对甲苯磺酸甲酯平均回收率为94.1％，rsd为2.7％，对甲苯磺酸乙酯平均回收率为99.5％，rsd为2.2％，该方法检测对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的准确度良好。

实施例5：

1、标准储备液的制备与实施例1相同；

2、液相色谱条件与实施例1相同。

3、样品前处理：其余步骤和实施例1相同，只是用1mol/l氢氧化钠溶液调节ph至8.5。

4、方法学验证和实施例1相同，结果表明，对甲苯磺酸甲酯测定平均回收率为99.0％，rsd为2.3％，对甲苯磺酸乙酯测定平均回收率为105.8％，rsd为1.2％，该方法检测对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的准确度良好。

实施例6：

1、标准储备液的制备与实施例1相同；

2、液相色谱条件与实施例1相同。

3、样品前处理：其余步骤和实施例1相同，只是用1mol/l氢氧化钠溶液调节ph至9.5。

4、方法学验证和实施例1相同，结果表明，对甲苯磺酸甲酯测定平均回收率为86.1％，rsd为2.3％，对甲苯磺酸乙酯测定平均回收率为107.2％，rsd为0.8％，该方法检测对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的准确度良好。

实施例7：

1、标准储备液的制备与实施例1相同；

2、液相色谱条件与实施例1相同。

3、样品前处理：其余步骤和实施例1相同，只是取出强力振摇后，静置0.5小时。

4、方法学验证和实施例1相同，结果表明，对甲苯磺酸甲酯测定平均回收率为91.5％，rsd为3.2％，对甲苯磺酸乙酯测定平均回收率为102.8％，rsd为2.3％，该方法检测对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的准确度良好。

实施例8：

1、标准储备液的制备与实施例1相同；

2、液相色谱条件与实施例1相同。

3、样品前处理：其余步骤和实施例1相同，只是取出强力振摇后，静置1.5小时。

4、方法学验证和实施例1相同，结果表明，对甲苯磺酸甲酯测定平均回收率为95.5％，rsd为2.1％，对甲苯磺酸乙酯测定平均回收率为95.8％，rsd为2.9％，该方法检测对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的准确度良好。

实施例9：

1、标准储备液的制备与实施例1相同；

2、液相色谱条件中柱温为30℃，其余与实施例1相同。

3、样品前处理：与实施例1相同。

4、方法学验证和实施例1相同，结果表明，对甲苯磺酸甲酯平均回收率为93.2％，rsd为1.8％，对甲苯磺酸乙酯平均回收率为102.6％，rsd为2.6％，该方法检测对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的准确度良好。

实施例10：

1、标准储备液的制备与实施例1相同；

2、液相色谱条件中柱温为40℃，其余与实施例1相同。

3、样品前处理：与实施例1相同。

4、方法学验证和实施例1相同，结果表明，对甲苯磺酸甲酯平均回收率为90.4％，rsd为3.5％，对甲苯磺酸乙酯平均回收率为90.6％，rsd为1.9％，该方法检测对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的准确度良好。

实施例11：

1、标准储备液的制备与实施例1相同；

2、液相色谱条件中流速为0.8ml/min，其余与实施例1相同。

3、样品前处理：与实施例1相同。

4、方法学验证和实施例1相同，结果表明，对甲苯磺酸甲酯平均回收率为101.5％，rsd为3.1％，对甲苯磺酸乙酯平均回收率为106.5％，rsd为3.0％，该方法检测对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的准确度良好。

实施例12：

1、标准储备液的制备与实施例1相同；

2、液相色谱条件中流速为1.2ml/min，其余与实施例1相同。

3、样品前处理：与实施例1相同。

4、方法学验证和实施例1相同，结果表明，对甲苯磺酸甲酯平均回收率为92.6％，rsd为3.5％，对甲苯磺酸乙酯平均回收率为107.2％，rsd为2.0％，该方法检测对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的准确度良好。

综上所述，本发明方法能够有效的分离al58805中的对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯，能够准确、快速测定基因毒性杂质对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯，该方法简单、快速、准确、有效，精密度高，专属性强，是测定al58805原料药或包含al58805的药物制剂中对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的理想方法。