pH = 7.8，含2wt%BSA、4wt%蔗糖)，4°C封闭12小时或过夜;最后用0.05mol/LTris-HCl，pH=7.8)洗涤标记好的荧光纳米探针 3 遍，然后用 500yL 0.05mol/L Tri s.HCl (pH= 7.8，含0.9wt %NaCl、
0.2wt%BSA,0.1wt% NaN3)悬浮，得到荧光纳米探针，备用。
[0075]实施例3
[0076]A)荧光纳米探针的TEOS纳米内核的合成:取10yL上述实施例1或实施例2所述的前驱体和300yL超纯水加入到1mL由非离子表面活性剂TritonX-1OO形成的反相胶束体系中进行凝胶化反应。反相胶束体系按照TritonX-1OO，正己醇，环己烷三者体积比1:1:3混合，快速搅拌均匀制备反相胶束。在上述体系中加入10yL TEOS，加快搅拌速度，促使TEOS进入反相胶束中的“纳米水池”，然后加入50yL NH4OH引发水解反应。室温反应24h，使水解和缩合反应进行充分，将收集的产物分散在等体积的丙酮中，在冰水浴中超声震荡5min，高速离心沉淀，将沉淀分散在乙醇相中进行充分洗涤，保存在无水乙醇中备用。其示意图如图1中的标号I。
[0077]B)荧光纳米探针TEOS壳层的制备:①如图1中的标号2所示，取I mL浓度约为1mg/mL悬浮于无水乙醇中的荧光纳米探针TEOS纳米内核，加入IyL APTMS，室温搅拌2小时，随后加热到69°C，并持续加热保持5min，最后用无水乙醇洗涤3遍，并悬浮于I mL无水乙醇中！②如图1中的标号3所示，取上述表面修饰有氨基的TEOS纳米内核I mL，浓度约为1mg/mL，加入0.5mg BHHCT，室温搅拌2h，无水乙醇洗涤2遍后，以ImL Tris.HCl(0.05mol/L，pH 7.8)悬浮，最后以无水乙醇洗涤3遍，并悬浮于I mL无水乙醇中，然后加入0.5mg E11CI3，避光搅拌反应2h，获得螯合新一层Eu3+的纳米探针;③TEOS壳层的制备:取上述键合有稀土螯合物的荧光纳米I mL，浓度约为10mg/mL，加入10yLTEOS，室温，避光搅拌2h，随后加热到69°C，并持续加热保持5min，最后用无水乙醇洗涤I遍，并悬浮于I mL无水乙醇中。重复步骤①-③2-4次。最后重复①步骤在其表面修饰氨基，备用，其如图1中的标号4所示。图2为修饰有氨基的荧光纳米探针的放大的示意图。
[0078]3.荧光纳米探针与抗体偶联
[0079]取抗体50(^1^，对0.0111101/1 pH 5.2醋酸钠缓冲液，4°C透析6h;然后加入Nal(k，终浓度为0.0Im01/L，对抗体进行氧化，20分钟后，再次对0.0lmol/L pH5.2醋酸钠缓冲液透析，然后加入表面带有氨基的荧光纳米探针500yL，混匀，4°C过夜；加入NaBH3CN,终浓度为
0.005mol/L，4°C反应2h；再加入等体积的封闭液(0.05mol/L Tris.HCl ,pH = 7.8，含2wt%BSA、4wt%蔗糖)，4°C封闭12小时或过夜;最后用0.05mol/LTris-HCl，pH=7.8)洗涤标记好的荧光纳米探针 3 遍，然后用 500yL 0.05mol/L Tri s.HCl (pH= 7.8，含0.9wt %NaCl、
0.2wt%BSA,0.1wt% NaN3)悬浮，得到荧光纳米探针，备用。
[0080]实施例4
[0081 ]微流控芯片的制备:本微流控芯片的结构为包括I3DMS本体8，所述的PDMS本体8的中央设有进样口 81，所述的PDMS本体8内设有6条与进样口 81连接的进样通道82和I条与进样口 81连接的控制通道83，所述的进样通道82的末端和控制通道83的末端均设有出口 84，所述的进样通道82和控制通道83内均设有多个柱状的凸起85。
[0082]凸起85的剖面形状为正六边形，当然在实际应用过程中，凸起85的剖面形状还可以为椭圆形或者其他形状。
[0083]凸起85的顶部与进样通道82或控制通道83的顶部连接。
[0084]芯片主体采用PDMS-PDMS结构，以模塑法制作，具体步骤如下:
[0085]a)硅模具制作:模具的制作包括绘制版图、制作掩模和光刻三个标准步骤。
[0086]b)PDMS基片的制作:将Sylgard 184硅橡胶弹性体和Sylgard 184固化剂以质量比10:1的比例混合，搅拌均匀，在真空干燥箱中脱气，倾倒在硅模具表面，在真空干燥箱中以80°(3烘烤15分钟，取出，冷却，剥离。得到具有7条微通道的PDMS基片。
[0087]c)键合封装:将含有微通道的PDMS打孔，确定微流控进口和出口；然后将此PDMS基片和另一片平整的PDMS切成芯片单元。以氧气等离子体方法键合。芯片制作完毕。
[0088]d)表面修饰及功能化:表面等离子体处理后，把两块PDMS键合，然后立刻开始表面处理程序。从进样通道82和控制通道83的出口 84加样，中间的进样口 81施加真空将试剂抽过去。
[0089]抗体的固定程序如下:氧等离子处理MMS进样通道82、控制通道83和平整的PDMS膜5-10分钟(18秒，50瓦，0.2毫巴，标况下250mL/min)，然后键合成整芯片；以4.0mL/min的速度从进样口 81通入5.0的％的3_氨基丙基三乙氧基硅烷溶液(95wt%乙醇一 5wt%双蒸水混合溶液)10分钟。停止流动，孕育15分钟，依次用乙醇冲洗15分钟和通空气吹洗，然后在80°(3烘30分钟。随后，注入戊二醛溶液(1.0wt%的水溶液，Ph = 9.2) 10分钟后静止，在碱性条件下培育15分钟，使表面氨基与交联剂戊二醛反应。用0.1M碳酸钠缓冲液(pH=9.2)冲洗通道，然后注入抗体溶液(0.2mg/mL抗体分散于pH 9.2的0.1M碳酸钠缓冲液，含0.05 %Tween-20)10分钟。孕育2011^11后，使用0.51 Tris缓冲液(pH 9.0)-0.05wt%Tween混合液封闭未反应的戊二醛。为了减少非特异性蛋白质的吸附，通入1.0wt %的牛血清白蛋白溶液(1mMPBS,pH 7.4)，培育20分钟，然后用1mM PBS冲洗干净。
[0090]实施例5
[0091]牛奶中危害因子的检测
[0092]以牛奶中肠出血性大肠杆菌0157:H7、沙门氏菌、单增李斯特菌三种致病菌的同步检测为例。
[0093]具体步骤如下:步骤1:从实施例4所制备的微流控芯片的进样口81加入待测样品，使样品进入微流控芯片的检测通道52中；在微流控芯片中设有6条检测通道52和一条控制通道83。检测通道52和控制通道83结构相同，均设有多个截面为六边形的凸起。控制通道83不做任何修饰，即不固定任何抗体，在本实施例中为设置的阴性对照，因为按照设计在控制通道83中没有任何抗体存在，则无法捕获待测物，也无法形成夹心结构而产生荧光信号;这一阴性对照设置的目的是排除通道表面的非特异性吸附造成的干扰；
[0094]其中的两条检测通道52设置为肠出血性大肠杆菌0157:H7的检测通道，通道内固定肠出血性大肠杆菌0157: H7的单克隆抗体；
[0095]另外的两条检测通道52设置为沙门氏菌的检测通道，通道内固定沙门氏菌的单克隆抗体；
[0096]剩余的两条检测通道52设置为单增李斯特菌的检测通道，通道内固定单增李斯特菌的单克隆抗体；
[0097]步骤2:将缓冲液从进样口81加入检测通道52中，冲洗数次；
[0098]步骤3:从进样口中加入荧光纳米探针溶液，荧光纳米探针如实施例1中公开，使荧光纳米探针进入检测通道中；荧光纳米探针溶液中含有三种特定的荧光纳米探针，其中一种荧光纳米探针的表面所修饰的肠出血性大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体；另外一种荧光纳米探针的表面所修饰沙门氏菌的单克隆抗体;剩余的一种荧光纳米探针的表面所修饰单增李斯特菌的单克隆抗体。
[0099]步骤4:将缓冲液从进样口81加入检测通道中，冲洗数次；
[0100]步骤5:用荧光显微镜或时间分辨荧光仪检测检测通道52中的荧光信号。
[0101]其具体的检测原理为:若牛奶中有肠出血性大肠杆菌0157:H7，则在肠出血性大肠杆菌0157: H7的检测通道内的抗体会与牛奶中的肠出血性大肠杆菌0157: H7特异性结合，固定住抗原肠出血性大肠杆菌0157:H7，然后荧光纳米探针溶液中修饰有肠出血性大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体的荧光纳米探针与抗原肠出血性大肠杆菌0157:H7特异性结合，这样经过荧光显微镜或时间分辨荧光仪检测得到该检测通道52内的荧光强度，即可得知样品中是否存在肠出血性大肠杆菌0157:H7以及肠出血性大肠杆菌0157:H7的浓度是多少。该检测原理也可以形象的称为“三明治”或“夹心法”检测法。荧光强度越大则说明肠出血性大肠杆菌0157:H7的浓度越大。
[0102]沙门氏菌的检测通道和单增李斯特菌的检测通道的检测原理同上，在此不做过多重复。
[0103]在本实施例中，如有必要，还可以预先设计不同种类的荧光纳米探针的Eu3+和Tb3+的摩尔比例，不同比例的Eu3+和Tb3+的混合在特征峰并未发生变化，仅在于峰型上展示一些变化，这得益于外层的“layer-by-layer”包裹。
[0104]具体如图5所示，在本实施例的焚光纳米探针中，无论是Tb纳米、Eu纳米还是混合包裹的Eu/Tb纳米都具有一致的激发和发射光谱。调整Eu与Tb 二者浓度的混合比例能够制备多色荧光纳米，其所制备出的多色荧光纳米探针的激发波长是保持一致的，如图谱A、B所示，BBCAP-Eu，BBCAP-Tb的激发波长为280nm。随着掺入Tb与Eu摩尔比例的不同，形成的多色荧光纳米探针在峰型上展示了一些变化，如图谱C所示。具体来说，图5中，横坐标为波长，纵坐标为强度。图谱A中，左侧虚线是BBCAP-Tb的激发光谱，右侧虚线是BBCAP-Tb的发射光谱，左侧实线是掺杂Tb的二氧化硅荧光纳米探针的激发光谱，右侧实线是掺杂Tb的二氧化硅荧光纳米探针的发射光谱；图谱B中，左侧虚线是BBCAP-Eu的激发光谱，右侧虚线是BBCAP-Eu的发射光谱，左侧实线是掺杂Eu的二氧化硅荧光纳米探针的激发光谱，右侧实线是掺杂Eu的二氧化硅荧光纳米探针的发射光谱；图谱C中a、b