转移酶、差向异构酶、编码它们的多核苷酸及其用途的制作方法

专利名称：：转移酶、差向异构酶、编码它们的多核苷酸及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及制备植物的组合物和方法。所述植物具有改变GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性和/或改变的GDP-D-甘露糖差向异构酶活性和/或改变的抗坏血酸含
背景技术：
：抗坏血酸是植物中最丰富的可溶性抗氧化剂，其对于人和一些其他动物也是首要的营养素。抗坏血酸显著地有助于人类膳食中"游离自由基清除剂"或"抗氧化代谢产物"的全面摄入。令人信服的证据现在表明，这种代谢产物作为抗癌症形成剂和预防冠心病单独或者联合地有助于健康和身体。人类摄入的几乎全部的膳食抗坏血酸来源于植物产品。然而，植物组织的抗坏血酸含量显著不同。同时，草本和木本植物中，叶子的抗坏血酸含量一般很高并相对一致，在非绿色的可食用的植物组织中，发现的抗坏血酸含量有巨大的无法解释的不同。例如，在果实中，在Mz7r/an'aJW/a的卡姆果rcamucamu)中高达30mggFW-lAsA，而在Afe^//^genwaw/ca的枸禾己(medlar)中低于3|iggFW陽lAsA(Rodriguez等人1992,JChromatogrSci,30:433-437)。已报道猕猴桃中抗坏血酸值变化很大(Ferguson,A.R.，Botanicalnominclature:J"/mW<3c/n'we肌、y4c".mWat/Wc/ay",and」W/<i/fl"toy".kiwifruit:scienceandmanagement,ed.I.J.Warrington禾卩G.C.Weston.1990,PalmerstonNorth;NewZealand:NewZealandSocietyforHorticulturalScience.576.Beever，D.J禾口G.Hopkirk,Fruitdevelopmentandfruitphysiology.Kiwifruit:scienceandmanagement,ed.I.J.WarringtonandG.C.Weston.1990,PalmerstonNorth;NewZealand:NewZealandSocietyforHorticulturalScience.576.)。不同的藤蔓植物水果的抗坏血酸含量，对于美味猕猴桃(A^"c/ora)范围是30-400mg/100g(Ferguson,A.R.,1991ActaHort.290:p.603-656,Spano,D.,等人，1997ActaHort.,.444:p.501-506.)，而对于栽培品种"Hayward"报道的范围是80-120mg/100g(Beever，D.J禾口G.Hopkirk,Fruitdevelopmentandfruitphysiology.Kiwifruit:scienceandmanagement,ed.I.J.Warrington禾卩G.C.Weston.1990,PalmerstonNorth;NewZealand:NewZealandSocietyforHorticulturalScience.576.)。据报道，软枣猕猴桃".wgwto)、中华猕猴桃".cW"e"&)(Muggleston,S.等人，Orchardist,1998.71(8):p.38-40,Chen,Q.和Q.Chen,CropGeneticResources,1998(2):p.3，Coggiatti，S.,1971ItalAgr，Oct,.108(10):p.935-941)、金花猕猴桃".c/7，朋Aa)和葛枣猕猴桃(^po(K^ma)的果实中含有较高浓度的抗坏血酸，在毛花猕猴桃(Aw/fl"决a)和阔叶猕猴桃(A中水平非常高(>1%鲜重)(Ferguson1991ActaHort.290:p.603-656.禾卩Ayto/om汰to(Kola,J.和J.Pavelka,1988Nahrung，.32(5):p.513-515)。已提出植物中生物合成抗坏血酸的三种途径，一种是通过L-半乳糖(L-Gal)(Wheeler等人1998,淑騰393，365-369)，另一种是由肌醇(myoinositol)合成(Loe雨s和Kelly,1961,爿rc/z.历oc/e附.5/op/^&95,483-493;Lorence等人，(2004)P/a"f尸/^w'o/.134，1200-1205)，第三种途径是通过半乳糖醛酸(Agius等人2003，淑万她c/mo/21，177-81)。L-Gal途径通过L-半乳糖生成半乳糖酸-l，4-内酯(galactono-l,4-lactone)，并因此形成抗坏血酸(Wheeler等人1998,Atow"393，365-369)。迄今为止，对于L-半乳糖途径，已经鉴定出来或至少部分鉴定出来编码这些酶的所有基因和他们相关的酶活性，除了一种将GDP-L-半乳糖转化成L-半乳糖-l-磷酸的推测的酶。被鉴定的基因和酶活性包括GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(Conklin,1998;Conklin等人，1999;Keller等人，1999)，GDP-D-甘露糖3',5'-差向异构酶(Wolucka等人，2001;Wolucka和VanMontagu,2003;Watanabe等人，2006)，L-半乳糖-l-P磷酸酶(Laing等人，2004;Conklin等人，2006)，L-半乳糖脱氢酶(Wheeler等人，1998;Gatzek等人，2002;Laing等人，2004)和L-半乳糖酸-l,4-内酯脱氢酶(Imai等人,1998;Bartoli等人，2005)。缺失的酶，没有报道(最大限度地就申请人所知)其作为提取的或纯化的酶活性，或者作为表达基因用于分析，其催化抗坏血酸生物合成的第二关键步骤(committedstep)。在抗臭氧的筛选中鉴定出拟南芥64ra6/tfo;w&Aa//awaJ游FTC2突变体，其还显示出特别低的抗坏血酸水平的特征(Conklin等人,2000)。使用基于图的方法来克隆突变基因Uander等人,2002)，并作为编码新型蛋白的基因(At4g26850)将其鉴定。然而，据报该基因与拟南芥属64ra6zWo/w^J的其他基因无同源性，除了同样未鉴定的At5g55120和其他物种的其他未鉴定基因。据报道编码的蛋白与拟南芥属蛋白MC015.7，秀丽隐杆线虫(Cae"w/wW^e/egara)蛋白C10F3.4和黑腹果蝇(Z)raw;/n7ame/a朋g氾妙)蛋白质CG3552最相似，这些蛋白中无一具有证实的功能。尽管已报道拟南芥属基因(AtAg26850)与FTC2突变体的四个等位基因互补，然而未提供细节(Jander等人，2002)。另外作者陈述"尽管我们有与VTC2突变相关的表型，然而在这些突变体中还需要发现导致维生素C水平下降的调节途径或生物合成途径"。在产生抗坏血酸的生物合成途径中鉴定编码酶的基因，给以基于基因的方法操纵植物中抗坏血酸含量提供了机会。然而，尽管对于生物合成抗坏血酸的L-半乳糖途经的许多步骤，已经产生在L-半乳糖途经中不同基因表达改变的转基因植物或突变体，降低的基因表达(和酶的水平)能导致抗坏血酸降低，过表达不导致叶子中抗坏血酸增加(Ishikawa等人，2006和Conklin等人，2006)。本发明的目标是为调节GDP-L-半乳糖脒基转移酶(也称作GDP-L-半乳糖磷酸化酶)活性；和/或GDP-D-甘露糖差向异构酶的活性；和/或植物中的抗坏血酸含量提供改进的组合物和方法，或至少为公众提供有用的选择。
发明内容第一方面，本发明提供制备具有增加GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性(也称作GDP-L-半乳糖磷酸化酶)的植物细胞或植物的方法，所述方法包含用编码多肽(具有SEQIDNO:1至11中任一氨基酸序列)或该多肽变体的多核苷酸转化植物细胞或植物，其中该变体具有GDP-L-半乳糖脒基转移酶的活性。在一个具体实施方式中，该变体包含氨基酸序列AINVSPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)。在另一个具体实施方式中，变体包含氨基酸序列GYNSLGAFAT腿LHFQAY(SEQIDNO:13)。在另一个具体实施方式中，变体包含SEQIDNO:12和SEQIDNO:13.序列。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:1至11中任一个的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:1至11中任一个的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:1的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:1的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:6的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:6的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:7的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:7的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:8的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:8的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:9的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:9的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:IO的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:10的多肽。在另一方面，本发明提供制备具有增加GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性的植物细胞或植物的方法，该方法包含用多核苷酸(包含选自SEQIDNO:14至24之中任一序列的核苷酸序列)或其变体转化植物细胞或植物，其中该变体编码具有GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性的多肽。在一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:14至24之中任一序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:14至24之中的任一序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含编码序列SEQIDNO:14至24之中任一序列的全长。在另一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:14具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:14。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:14的全长编码序列具有至少60%的序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含编码序列SEQIDNO:14的全长。在另一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:19具有至少60%的序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:19。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:19全长编码序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:19的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:20具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:20。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:20全长编码序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:20全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:21具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:21。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:21全长编码序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:21的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:22具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:22。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:22全长编码序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:22的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:23具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:23。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:23的全长编码序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:23的全长编码序列。优选地，通过本发明所述的方法制备的具有增加GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性的植物或植物细胞还具有增加的抗坏血酸含量。在另一方面，本发明提供具有增加抗坏血酸含量的植物或植物细胞的方法，该方法包含用编码多肽(具有SEQIDNO:l至ll中任一个的氨基酸序列)或多肽变体的多核苷酸转化植物细胞或植物，其中该变体具有GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性。在一个具体实施方式中，变体包含氨基酸序列AINVSP正YGHVLLIP(SEQIDNO:12)。在另一个具体实施方式中，变体包含氨基酸序列GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)。在另一个具体实施方式中，变体包含序列SEQIDNO:12和SEQIDNO:13.13在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:l至ll中任一个的多肽具有至少60%序列同一性。在另一个具体实施方式中，多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:l至ll中任一个的多肽。在另一个具体实施方式中少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中的多肽。在另一个具体实施方式中少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中的多肽。在另一个具体实施方式中少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中的多肽。在另一个具体实施方式中少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中的多肽。在另一个具体实施方式中少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中的多肽。在另一个具体实施方式中至少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中的多肽。在优选的具体实施方式中，该方法进一步包含用编码多肽(具有氨基酸序列SEQIDNO:25至35之中任一个)或该多肽变体的多核苷酸转化植物细胞或植物，其中变体具有GDP-D-甘露糖差向异构酶活性。在一个具体实施方式中，变体包含氨基酸序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。在另一个具体实施方式中，变体包含氨基酸序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。在另一个具体实施方式中，变体包含SEQIDNO:36和SEQIDNO:37序列。变体与氨基酸序列是SEQIDNO:l的多肽具有至a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:1变体与氨基酸序列是SEQIDNO:6的多肽具有至a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:6变体与氨基酸序列是SEQIDNO:7的多肽具有至a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:7变体与氨基酸序列是SEQIDNO:8的多肽具有至a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:8变体与氨基酸序列是SEQIDNO:9的多肽具有至a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:9变体与氨基酸序列是SEQIDNO:10的多肽具有a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:10在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:25至35之中任一个的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:25至35之中任一个的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽。以转移酶和差向异构酶转化可以任一顺序连续进行。另外，以差向异构酶和转移酶转化可同时发生。当同时发生时，编码差向异构酶和转移酶的序列可在同一构建体或载体上或分别在不同构建体或载体上。在另一方面，本发明提供制备具有增加抗坏血酸的植物细胞或植物的方法，该方法包含用多核苷酸(包含选自SEQIDNO:14至24之中任一序列的核苷酸序列)或其变体转化植物细胞或植物，其中变体编码具有GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性的多肽。在一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:14至24之中的任一个具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:14至24之中的任一序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:14至24之中任一个的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:14具有至少60%的序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:14。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:14的全长编码序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:14的全长编码序列。15在另一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:19具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:19。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:19的全长编码序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:19的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:20具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:20。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:20的全长编码序列具有至少60%的序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:20的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:21具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:21。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:21全长编码序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:21的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:22具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:22。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:22全长编码序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:22的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:23具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:23。在一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:23的全长编码序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:23的全长编码序列。在优选的具体实施方式中，方法进一步包含用多核苷酸(包含选自SEQIDNO:38至48之中任一序列的核苷酸序列)或其变体转化植物细胞或植物，其中该变体编码具有GDP-D-甘露糖差向异构酶活性的多肽。在一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:38至48中任一个具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:38至48中的任一个。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38至48中任一个的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:38具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:38的全长编码序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:39序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:39序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:39的全长编码序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:39的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:40序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:40序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:40的全长编码序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:40的全长编码序列。以转移酶和差向异构酶进行转化可以任一顺序连续进行。或者以差向异构酶和转移酶同时进行转化。当同时进行转化时，编码差向异构酶和转移酶的序列可在同一构建体或载体上，或分别在不同的构建体或载体上。在另一方面，本发明提供制备具有增加GDP-D-甘露糖差向异构酶活性的植物细胞或植物的方法，该方法包含用编码多肽(具有SEQIDNO:25至35之中任一氨基酸序列)或多肽变体的多核苷酸转化植物细胞或植物，其中该变体编码具有GDP-D-甘露糖差向异构酶活性。在一个具体实施方式中，变体包含氨基酸序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。在另一个具体实施方式中，变体包含氨基酸序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。在另一个具体实施方式中，变体包含SEQIDNO:36和SEQIDNO:37序列。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:25至35中任一个的多肽具有至少70%序列同一性。在另一个具体实施方式中，多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:25至35中任一个的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽具有至少70%序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽具有至少70%序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽具有至少70%序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽。在另一方面，本发明提供制备具有增加GDP-D-甘露糖差向异构酶活性的植物细胞或植物的方法，该方法包含用多核苷酸(包含选自序列SEQIDNO:38至48之中任一个的核苷酸序列)，或其变体转化植物细胞或植物，其中该变体编码具有GDP-D-甘露糖差向异构酶活性的多肽。在另一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:38至48之中任一个具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:38至48中的任一个。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38至48中任一个的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:38序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:38全长编码序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:39具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:39。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:39的全长编码序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:39的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与序列SEQIDNO:40具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:40。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:40的全长编码序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:40的全长编码序列。在第一方面，本发明提供制备具有增加抗坏血酸含量的植物细胞或植物的方法，该方法包含用编码多肽(具有SEQIDNO:25至35之中任一个氨基酸序列)或多肽变体的多核苷酸转化植物细胞或植物，其中该变体具有GDP-D-甘露糖差向异构酶活性。在一个具体实施方式中，变体包含氨基酸序列AA固GGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。在另一个具体实施方式中，变体包含氨基酸序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。在另一个具体实施方式中，变体包含序列SEQIDNO:36禾卩SEQIDNO:37。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:25至35之中任一个的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:25至35之中任一个的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽。在一个优选的具体实施方式中，本发明提供制备具有增加抗坏血酸含量的植物细胞或植物的方法，也可用编码GDP-L-半乳糖-脒基转移酶的多核苷酸转化该植物或植物细胞。以差向异构酶和转移酶进行转化可以任何顺序连续进行。或者可以差向异构酶和转移酶同时进行转化。当同时进行转化时，编码差向异构酶和转移酶的序列可在同一构建体或载体上，也可分别在不同构建体或载体上。优选地，GDP-L-半乳糖脒基转移酶具有SEQIDNO:1至11的氨基酸序列，或该多肽的变体，其中该变体具有GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性。在一个具体实施方式中，变体包含氨基酸序列A雨SP正YGHVLLIP(SEQIDNO:12)。在另一个具体实施方式中，变体包含氨基酸序列GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)。在另一个具体实施方式中，变体包含SEQIDNO:12和SEQIDNO:13序列。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:l至ll之中任一个的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:1至11之中任一个的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:1的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:l的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:6的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:6的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:7的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:7的20多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:8的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:8的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:9的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:9的多肽。在另一个具体实施方式中，变体与氨基酸序列是SEQIDNO:IO的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸编码氨基酸序列是SEQIDNO:10的多肽。在另一方面，本发明提供制备具有增加抗坏血酸含量的植物细胞或植物的方法，该方法包含用多核苷酸(包含选自序列SEQIDNO:38至48之中任一个的核苷酸序列)或其变体转化植物细胞或植物，其中该变体编码具有GDP-D-甘露糖差向异构酶活性的多肽。在一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:38至48之中的任一序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38至48之中的任一序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38至48之中任一的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:38的序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:38。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:38的全长编码序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:39序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:39。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:39的全长编码序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:39的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:40的序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:40。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:40的全长编码序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:40的全长编码序列。制备具有增加抗坏血酸含量的植物细胞或植物方法的一个优选具体实施方式中，还是以编码GDP-L-半乳糖脒基转移酶的多核苷酸转化植物或植物细胞。以差向异构酶和转移酶进行转化可以任何顺序连续进行。或者可以差向异构酶和转移酶同时进行转化。当同时进行转化时，编码差向异构酶和转移酶的序列可在同一构建体或载体上，也可分别在不同构建体或载体上。优选地，编码GDP-L-半乳糖脒基转移酶的多核苷酸具有选自SEQIDNO:14至24之中的任一序列或其变体的核苷酸序列，其中该变体编码具有GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性的多肽。在一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:14至24.之中任一序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:14至24之中的任一序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:14至24之中任一全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:14的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:14。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:14全长编码序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:14的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:19的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:19。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:19的全长编码序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:19的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:20的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:20。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:20的全长编码序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:20的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:21的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:21。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:21的全长编码序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:21的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:22的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:22。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:22的全长编码序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:22的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:23的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:23。在另一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:23的全长编码序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:23的全长编码序列。在另一方面，本发明提供制备具有增加抗坏血酸含量的植物细胞或植物的方法，该方法包含以下列成分转化植物细胞或植物a)编码GDP-D-甘露糖差向异构酶的多核苷酸；和b)编码GDP-L-半乳糖脒基转移酶的多核苷酸。在一个具体实施方式中，GDP-D-甘露糖差向异构酶包含氨基酸序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。23在另一个具体实施方式中，GDP-D-甘露糖差向异构酶包含氨基酸序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。在另一个具体实施方式中，GDP-D-甘露糖差向异构酶包含与SEQIDNO:25至35之中任一个的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，GDP-D-甘露糖差向异构酶包含SEQIDNO:25至35之中任一个的氨基酸序列。在一个具体实施方式中，GDP-L-半乳糖脒基转移酶包含氨基酸序列A雨SPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)。在另一个具体实施方式中，GDP-L-半乳糖脒基转移酶包含氨基酸序列GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)。在另一个具体实施方式中，GDP-L-半乳糖脒基转移酶包含与SEQIDNO:1至11之中任一个的氨基酸序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，GDP-L-半乳糖脒基转移酶包含氨基酸序列是SEQIDNO:l至ll之中的任一个。在另一方面，本发明提供编码多肽(包含选自SEQIDNO:1至7之中任一个的序列)或其变体的分离的多核苷酸，其中变体是GDP-L-半乳糖脒基转移酶。在一个具体实施方式中，变体包含序列AINVSPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)。在另一个具体实施方式中，变体包含序列GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)。在另一个具体实施方式中，变体包含序列SEQIDNO:12禾BSEQIDNO:13。在另一个具体实施方式中，多肽包含与SEQIDNO:1至7中任一序列具有至少72%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多肽包含SEQIDNO:l至7中任一个的序列。在另一个具体实施方式中，多肽包含与SEQIDNO:1的序列具有至少75%同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:1。在另一个具体实施方式中，多肽包含与SEQIDNO:2的序列具有至少74%同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:2。在另一个具体实施方式中，包含与SEQIDNO:3的序列具有至少75%同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:3。在另一个具体实施方式中，多肽包含与SEQIDNO:4的序列具有至少78%同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:4。在另一个具体实施方式中，多肽包含与SEQIDNO:5的序列具有至少75%同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:5。在另一个具体实施方式中，多肽包含与SEQIDNO:6的序列具有至少72%同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:6。在另一个具体实施方式中，多肽包含与SEQIDNO:7的序列具有至少73%同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:7。在另一方面，本发明提供分离的多核苷酸(包含SEQIDNO:14至20之中任一个的全长编码序列)或其变体，其中变体编码GDP-L-半乳糖脒基转移酶。在一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:14至20之中任一个的全长编码序列具有至少68%序列同一性的序列。在一个具体实施方式中多核苷酸包含SEQIDNO:14至20之中任一个的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:14至20之中任一个序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含与SEQIDNO:14的全长编码序列具有至少68%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:14序列之内的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:14。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含与SEQIDNO:15的全长编码序列具有至少69%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:15序列内的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:15。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含与SEQIDNO:16的全长编码序列具有至少66%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含SEQIDNO:16序列内的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:16。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含与SEQIDNO:17的全长编码序列具有至少69%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:17序列内的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:17。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含与SEQIDNO:18的全长编码序列具有至少69%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:18序列内的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:18。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含与SEQIDNO:19的全长编码序列具有至少68%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含SEQIDNO:19序列内的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:19。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含与SEQIDNO:20的全长编码序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:20序列内全长编码序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:20。在另一方面，本发明提供包含氨基酸序列是SEQIDNO:1至7的分离的多肽或其变体，其中该变体具有GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性。在一个具体实施方式中，变体多肽与选自SEQIDNO:1至7之中任一个的氨基酸序列具有至少72%序列同一性，其中该变体具有GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性。在另一个具体实施方式中，分离的多肽与氨基酸序列是SEQIDNO:1的多肽具有至少75%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，分离的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:1。在另一个具体实施方式中，分离的多肽具有与氨基酸序列SEQIDNO:2具有至少74%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，分离的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:2。在另一个具体实施方式中，分离的多肽与氨基酸序列SEQIDNO:3具有至少75%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，分离的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:3。在另一个具体实施方式中，分离的多肽与氨基酸序列SEQIDNO:4的多肽具有至少78%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，分离的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:4。在另一个具体实施方式中，分离的多肽与氨基酸序列SEQIDNO:5具有至少75%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，分离的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:5。在另一个具体实施方式中，分离的多肽与氨基酸序列是SEQIDNO:6具有至少72%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，分离的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:6。在另一个具体实施方式中，分离的多肽与氨基酸序列SEQIDNO:7具有至少73%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，分离的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:7。在另一方面，本发明提供编码多肽(包含选自SEQIDNO:25至27之中任一序列)或其变体的分离的多核苷酸，其中变体是GDP-D-甘露糖差向异构酶。在一个具体实施方式中，变体包含序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。在另一个具体实施方式中，变体包含序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。在另一个具体实施方式中，变体包含序列SEQIDNO:36和SEQIDNO:37。在另一个具体实施方式中，多肽包含与SEQIDNO:25至27中任一序列具有至少91%同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多肽包含选自SEQIDNO:25至27中的任一序列。在另一个具体实施方式中，多肽包含与SEQIDNO:25序列具有至少91%同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:25。在另一个具体实施方式中，多肽包含与SEQIDNO:26序列具有至少91%同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:26。在另一个具体实施方式中，多肽包含与SEQIDNO:27中任一序列具有至少91%同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:27。在另一方面，本发明提供包含SEQIDNO:38至40中任一全长编码序列的分离的多核苷酸或其变体，其中变体编码GDP-D-甘露糖差向异构酶。在一个具体实施方式中，变体包含与SEQIDNO:38至40中任一全长编码序列具有至少70%序列同一性的序列。在一个具体实施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:38至40中任一全长编码序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含SEQIDNO:38至40的任一序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含与SEQIDNO:38的全长编码序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:38序列内的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:39序列内的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:39。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含与SEQIDNO:40的全长编码序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含SEQIDNO:40序列内的全长编码序列。在另一个具体实施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:40。在另一方面，本发明提供包含氨基酸序列SEQIDNO:25至27或其变体的分离的多肽，其中变体具有GDP-D-甘露糖差向异构酶活性。在一个具体实施方式中，变体多肽与选自SEQIDNO:25至27中任一氨基酸序列具有至少91%的序列同一性，其中变体具有GDP-D-甘露糖差向异构酶活性。在另一个具体实施方式中，分离的多肽与氨基酸序列SEQIDNO:25具有至少91%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，分离的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:25。在另一个具体实施方式中，分离的多肽与氨基酸序列SEQIDNO:26具有至少91%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，分离的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:26。在另一个具体实施方式中，分离的多肽与氨基酸序列SEQIDNO:27具有至少91%的序列同一性。在另一个具体实施方式中，分离多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:27。在另一方面，本发明提供编码本发明所述多肽的分离的多核苷酸。在另一方面，本发明提供包含下列成分的分离的多核苷酸a)包含本发明所述的多核苷酸的长度至少是15个核苷酸的片段的多核苷酸；b)包含本发明所述的多核苷酸的长度至少是15个核苷酸的互补的多核苷酸；或d)包含能与本发明所述的多核苷酸杂交的长度至少是15个核苷酸的序列的多核苷酸。在另一方面，本发明提供包含至少一个本发明所述的多核苷酸的遗传构建体。在另一方面，本发明提供包含至少一个本发明所述的多核苷酸的表达构建体。在另一方面，本发明提供包含至少一个本发明所述的多核苷酸的RNAi构建体。在另一方面，本发明提供包含本发明所述的表达构建体、遗传构建体或RNAi构建体的载体。在另一方面，本发明提供包含至少一个本发明所述的表达构建体或遗传构建体的宿主细胞。在另一方面，本发明提供遗传改造的宿主细胞，该细胞表达至少一个本发明所述的多核苷酸，或至少一个本发明所述的多肽。优选地，宿主细胞是遗传修饰的用于表达编码GDP-L-半乳糖脒基转移酶的多核苷酸；和编码GDP-D-甘露糖差向异构酶的多核苷酸。在另一方面，本发明提供制备GDP-L-半乳糖脒基转移酶的多肽的方法，该方法包含培养包含能表达GDP-L-半乳糖脒基转移酶多肽的本发明所述表达构建体或本发明所述遗传构建体的宿主细胞。在另一方面，本发明提供制备GDP-L-半乳糖脒基转移酶的酶产物的方法，该方法包含在酶的底物存在条件下，培养包括能表达GDP-L-半乳糖脒基转移酶多肽的本发明所述表达构建体或本发明所述遗传构建体的宿主细胞，所述的酶的底物可供应给宿主细胞或在宿主细胞中天然存在。在另一方面，本发明提供制备GDP-D-甘露糖差向异构酶多肽的方法，该方法包括培养包含能表达GDP-D-甘露糖差向异构酶多肽的本发明所述表达构建体或本发明所述遗传构建体的宿主细胞。在另一方面，本发明提供制备GDP-D-甘露糖差向异构酶的酶产物的方法，该方法包括在酶的底物存在条件下，培养包括能表达GDP-D-甘露糖差向异构酶多肽的本发明所述表达构建体或本发明所述遗传构建体的宿主细胞，所述的酶的底物可供应给宿主细胞或在宿主细胞中天然存在。在另一方面，本发明提供生物合成抗坏血酸的方法，该方法包含在抗坏血酸前体存在下，培养包含能表达GDP-L-半乳糖脒基转移酶的本发明所述表达构建体或本发明所述遗传构建体的宿主细胞的步骤，所述前体可补充给宿主细胞或在宿主细胞中天然存在。优选地，宿主细胞还包含能表达GDP-D-甘露糖差向异构酶的本发明所述表达构建体。在另一方面，本发明提供生物合成抗坏血酸的方法，该方法包含在抗坏血酸前体存在下，培养包含能表达GDP-D-甘露糖差向异构酶的本发明所述表达构建体或本发明所述遗传构建体的宿主细胞的步骤，所述前体可补充给宿主细胞或在宿主细胞中天然存在。优选地，宿主细胞还包含能表达GDP-L-半乳糖脒基转移酶的本发明所述表达构建体。优选地，宿主细胞是植物细胞。优选地，植物细胞是植物的一部分。在另一方面，本发明提供经遗传修饰的植物细胞，所述细胞表达至少一种本发明所述的多核苷酸，或至少一种本发明所述的多肽。在另一方面，本发明提供植物细胞，所述细胞包含至少一种本发明所述的表达构建体或至少一种本发明所述的遗传构建体的。在另一方面，本发明提供包含本发明所述的植物细胞的植物。在另一方面，本发明提供选择GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性改变的植物的方法，该方法包含试验用于本发明所述多核苷酸表达改变的植物。在另一方面，本发明提供选择GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性改变的植物的方法，该方法包含试验本发明所述多肽表达改变的植物。在另一方面，本发明提供选择GDP-D-甘露糖差向异构酶活性改变的植物的方法，该方法包含试验本发明所述多核苷酸表达改变的植物。在另一方面，本发明提供选择GDP-D-甘露糖差向异构酶活性改变的植物的方法，该方法包含试验本发明所述多肽表达改变的植物。在另一方面，本发明提供选择抗坏血酸含量改变的植物的方法，该方法包含试验本发明所述多核苷酸或多肽的表达改变的植物。在另一方面，本发明提供通过本发明所述的方法制备出来的植物细胞或植物。优选地，植物经遗传修饰，包括或表达本发明所述的多核苷酸或者多肽。在另一方面，本发明提供经本发明所述的方法选择出来的植物。在另一方面，本发明提供经本发明所述的方法选择出来的成组植物。优选地，该组包括至少2个，更优选至少3个，更优选至少4个，更优选至少5个，更优选至少6个，更优选至少7个，更优选至少8个，更优选至少9个，更优选至少10个，更优选至少11个，更优选至少12个，更优选至少13个，更优选至少14个，更优选至少15个，更优选至少16个，更优选至少17个，更优选至少18个，更优选至少19个，更优选至少20个植物。在另一方面，本发明提供制备抗坏血酸的方法，该方法包含从本发明所述的植物细胞或植物中提取抗坏血酸。在另一方面，本发明提供鉴定作为除草剂(herbicide)候选的化合物的方法，其包含a)将所述的化合物与包含选自SEQIDNO:1至11之中任一个序列或具有GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性的其变体的多肽接触；并且b)检测所述化合物与所述多肽之间的结合是存在和/或缺失，其中结合提示所述化合物是除草剂候选。在另一方面，本发明提供鉴定作为候选除草剂的化合物的方法，其包含a)将所述的化合物与包含选自SEQIDNO:1至11之中任一个序列或具有GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性的其变体的多肽接触；并且b)评价所述化合物对所述多肽的GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性的影响；其中活性下降提示所述的化合物是候选除草剂。在另一方面，本发明提供鉴定作为候选除草剂的化合物的方法，其包含a)将所述的化合物与包含选自SEQIDNO:25至35之中任一个序列或其变体的具有GDP-D-甘露糖差向异构酶活性的多肽接触；并且b)检测所述化合物与所述多肽之间的结合是存在和/或缺失，其中结合提示所述化合物是候选除草剂。在另一方面，本发明提供鉴定作为候选除草剂的化合物的方法，其包含a)将所述的化合物与包含选自SEQIDNO:25至35之中任一个的序列或具有GDP-D-甘露糖差向异构酶活性的其变体的多肽接触；并且b)评价所述化合物对所述多肽的GDP-D-甘露糖差向异构酶活性的影响；其中活性下降提示所述的化合物是候选除草剂。在另一方面，本发明提供经本发明所述的方法鉴定的化合物。在另一方面，本发明提供确定本发明所述的化合物是否具有除草剂活性的方法，其包含使植物或植物细胞与所述的候选除草剂接触，并检测所述植物或植物细胞的生长或存活的下降，其中所述下降是该化合物的除草剂活性的指征。在另一方面，本发明提供抗本发明所述多肽的抗体。在另一方面，本发明提供制备L-半乳糖-l-磷酸的方法，所述的方法包含使GDP-L-半乳糖和GDP受体(包括己糖-l-磷酸或磷酸)与包含本发明所述多核苷酸的表达构建体的表达产物接触以获得L-半乳糖-l-磷酸。在另一方面，本发明提供制备GDP-半乳糖的方法，所述的方法包含使GDP-甘露糖与包含本发明所述多核苷酸或本发明所述多肽的表达构建体的表达产物接触以获得GDP-半乳糖。另外，在本发明所述的所有方面的具体实施方式中，GDP-L-半乳糖脒基转移酶是GDP-L-半乳糖己糖-l-P-脒基转移酶。类似地，在本发明所述的所有方面的可选择的具体实施方式中，GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性是GDP-L-半乳糖己糖-l-P-脒基转移酶活性。GDP-L-半乳糖己糖-l-P-脒基转移酶不必须地限于使用己糖-l-P作为GDP受体，还可使用其它GDP受体，如磷酸和焦磷酸。优选地，其它GDP受体是磷酸。本发明所述的多核苷酸和多核苷酸的变体可来源于任何物种。多核苷酸和变体还可重组产生，还可是"基因重组"(geneshuffling)方法的产物。在一个具体实施方式中，多核苷酸或变体来源于植物物种。在另一个具体实施方式中，多核苷酸或变体来源于裸子植物物种。在另一个具体实施方式中，多核苷酸或变体来源于被子植物物种。在另一个具体实施方式中，多核苷酸或变体来源于双子叶(dicotyledonuous)植物物种。31本发明所述的多肽和多肽的变体可来源于任何物种。多核苷酸和变体还可是重组产生，还可由基因重组方法的产物表达而来。在一个具体实施方式中，本发明所述的多肽或变体可来源于植物物种。在另一个具体实施方式中，本发明所述的多肽或变体来源于裸子植物物种。在另一个具体实施方式中，本发明所述的多肽或变体来源于被子植物物种。在另一个具体实施方式中，本发明所述的多肽或变体来源于双子叶植物物种。本发明所述的植物细胞和植物，其包括那些其多核苷酸、变体多核苷酸、多肽和变体多肽来自任何物种的植物细胞和植物。在一个具体实施方式中，植物细胞和植物来自裸子植物物种。在另一个具体实施方式中，植物细胞和植物来自被子植物物种。在另一个具体实施方式中，植物细胞和植物来自双子叶植物物种。在另一个具体实施方式中，植物细胞和植物来自选自下列属但不限于下列属的水果物种猕猴桃属、苹果属(Ma/M)、柑橘属^CzYmy)、草莓属(Trag"n'a)或越桔属(Tflcc/"/調)。特别优选的水果植物物种是美味猕猴桃(JC^^7/"cfe//dOM)、中华猕猴桃".c/z/"潔^)、毛花猕猴桃".m'a"翻)、软麥猕猴桃".a，to)、四种猕猴桃物种的杂交品种、苹果(似fl/^ifowe幼'ca)和三叶海棠(Ma/ww/e6oW//)。在另一个具体实施方式中，植物细胞和植物来自选自下列属但不限于下列属的蔬菜物种芥属(5mw/ca)、番茄属(丄戸戸Wco")或茄属(5W朋,)。特别优选的蔬菜植物物禾中是番茄(Z^copers/co"^a^"ftwz)和土豆(SWamwn赫ems,)。在另一个具体实施方式中，植物细胞和植物来自单子叶植物物种。在另一个具体实施方式中，植物细胞和植物来自选自下列属但不限于下列属的农作物物种大豆属(G(yd"e)，玉蜀黍属(Zea)，大麦属(Z/oWe"m)或稻属特别优选的农作物物种是水稻(Ot加s加/va)，大豆(Gfyc/"ewax)和玉米(Zea附ajKsO。具体实施例方式在本说明书中引用专利说明书、其它外部文件或其它信息来源的地方，这通常是为讨论本发明的特征提供上下文的目的。除非是特意声明，否则对这类外部文件的参考不应解释为以任何权限承认这类文件，或这类信息来源是现有技术，或形成本领域一般公知常识的一部分。在本说明书中所使用的术语"包含"意味"至少由…部分组成"。当在本说明书中解释每个包括术语"包含"的陈述时，其他特征或者那些以该术语开始的特征也可出现。相关术语如"包括"和"含有"的解释方式相同。本文所使用的术语"多核苷酸"意味着任意长度的单或双链的脱氧核糖核酸或核糖核酸多聚体，但是优选至少是15个核苷酸，且以非限制性实施例，包括基因的编码和非编码序列、正义和反义序列的互补区、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、前-mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酸酶、重组多肽、分离的和纯化的天然存在的DNA或RNA序列、合成性RNA和DNA序列、核酸探针、引物和片段。本文所提供的多核苷酸序列的"片段"是连续的核苷酸子序列，其能够与感兴趣的靶向特异地杂交，例如与至少长度为15个核苷酸的序列杂交。本发明所述的片段包含本发明所述的多核苷酸的15个核苷酸，优选至少20个核苷酸，更优选至少30个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，更优选至少50核苷酸和最优选至少60个核苷酸的连续的核苷酸。多核苷酸序列片段能在反义、基因沉默，三螺旋或核酶技术中使用，或作为包括在芯片的引物、探针使用，或在本发明所述的基于多核苷酸的选择方法中使用。术语"引物"是指短的通常有自由的3'0H基团的多核苷酸，其与模板杂交并用于引发与靶向互补的多核苷酸的聚合作用。术语"探针"是指短的多核苷酸，其用于在基于杂交的检测中，检测与探针互补的多核苷酸序列。探针可由本文所定义的多核苷酸的"片段"组成。多彦微本文所使用的术语"多肽"包含任意长度的氨基酸链，但优选至少5个氨基酸，包括蛋白质全长，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。本发明所述的多肽可是纯化的天然产物，或可部分或全部用重组或合成技术制备。该术语可指多肽，多肽的聚合物，如二聚体或其它多聚体、融合多肽、多肽片段、多肽的变体或其衍生物。多肽的"片段"是多肽的子序列，其发挥对于该多肽的生物活性所需的功能和/或形成该多肽的三维结构。该术语可指能发挥上述酶的活性的多肽，多肽的聚合物如二聚体或其它多聚体、融合多肽、多肽片段、多肽的变体或其衍生物。本文公开的用于多核苷酸或多肽序列的术语"分离的"用于指从他们的天然细胞环境中提取出来的序列。分离的分子可经任何方法或包括生物化学、重组和合成技术方法的联合使用而获得。术语"重组"是指在其天然环境(context)中从其周围的序列中提取出来的多核苷酸序列，和/或与在其天然环境中没有的序列重组的多核苷酸序列。"重组"多肽序列通过从"重组"的多核苷酸序列翻译而制备。来源于特定属或物种的，关于本发明所述的多核苷酸或多肽的术语"来源于"是指与在那个属或物种中发现的天然的多核苷酸或多肽具有相同序列的多核苷酸或多肽。来源于一个特定属或物种的多核苷酸或多肽因此可合成或重组制备。,沐如在本文中所使用，术语"变体"是指区别于明确地鉴定过的序列的多核苷酸或多肽序列，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基被删除、取代或添加。变体可是天然出现的等位基因变体，或是非天然出现的变体。变体可来自相同的或来自其它物种，且可包含同源物(homologues)，旁系同源物(paralogues)和直系同源物(orthologues)。在某些具体实施方式中，本发明所述多肽变体和多肽变体与本发明所述多肽或多肽具有相同或相似的生物学活性。术语"变体"当指多肽时，该多肽包含所有形式的多肽和本文所定义的多肽。多提辦辦变体多核苷酸序列与本发明所述的序列优选显示出至少50%，更优选至少51%，更优选至少52%，更优选至少53%，更优选至少54%，更优选至少55%，更优选至少56%，更优选至少57%，更优选至少58%，更优选至少59%，更优选至少60%，更优选至少61%，更优选至少62%，更优选至少63%，更优选至少64%，更优选至少65%，更优选至少66%，更优选至少67%，更优选至少68%，更优选至少69%，更优选至少70%，更优选至少71%，更优选至少72%，更优选至少73%，更优选至少74%，更优选至少75%，更优选至少76%，更优选至少77%，更优选至少78%，更优选至少79%，更优选至少80%，更优选至少81%，更优选至少82%，更优选至少83%，更优选至少84%，更优选至少85%，更优选至少86%，更优选至少87%,更优选至少88%，更优选至少89%，更优选至少卯％，更优选至少91%，更优选至少92%，更优选至少93%，更优选至少94%，更优选至少95%，更优选至少96%，更优选至少97%，更优选至少98%，和最优选至少99%的同一性。在本发明所述多核苷酸的至少20个核苷酸位置，优选至少50个核苷酸位置更优选至少100个核苷酸位置的比较窗口内，和最优选在全长范围内发现同一性。能以下列方式确定多核苷酸序列同一性。使用BLASTN(来自BLAST程序组，version2.2.5[Nov2002])，将目标多核苷酸序列与候选多核苷酸序列在bl2seq中进行比较(bl2seq:TatianaA.Tatusova,ThomasL.Madden(1999),"Blast2序歹U…一种比较蛋白质和核苷酸序列的新工具"，FEMSMicrobiolLett.174:247-250)，可从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blastA)公开获得该软件。使用bl2seq的缺省参数，除了应关闭过滤低复杂性(lowcomplexity)部分。可使用下列的unix命令行参数检査多核苷酸序列的同一性bl2seq-i核苷酸seql-j核苷酸seq2-FF-pblastn参数-FF关闭过滤低复杂性部分。参数-p为成对序列选择合适的算法。bl2seq程序以行"同一性="中相同核苷酸的数目和百分数报告序列同一性。多核苷酸序列同一性还可通过使用全面序列比对程序(globalsequencealignmentprogram)(例如Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)计算候选和目的多核苷酸序列之间重叠部分的全长得出。在EMBOSS软件包的needle程序中发现Needleman-Wunsch全面比对算法的完全实施(Rice，P.Longden,I.禾卩Bleasby,A.EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,TrendsinGeneticsJune2000,vol16,No6.pp.276-277)，EMBOSS软件包能从http:〃www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/获得。欧洲生物信息学研究所服务器也提供在http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/上在线进行在两个序列之间进行EMBOSS-needle全面比对的工具。另夕卜，可使用GAP程序，该程序在无罚分末端空位(penalizingterminalgap)的条件下，计算两个序列优化的全面比对。下列文章描述了GAP:Huang,X.(1994)OnGlobalSequenceAlignment.ComputerApplicationsintheBiosciences10,227-235。计算多核苷酸的％序列同一性的优选方法是基于使用ClustalX对要比较的序列进行比对(Jeanmougin等人，1998,7>e"A说oc/2e附.Sc/.23，403-5.)。本发明所述的多核苷酸变体还包含那些与一个或多个经明确鉴定过的序列表现出相似性的变体，所述的经明确鉴定过的序列可能保存那些序列的功能等价性，和那些不能合理地预测是随机出现的变体。这种序列相对于多肽的相似性可使用公开可得到的NCBI上的BLAST程序组(version2.2.5[Nov2002])中bl2seq程序确定(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blast/)。多核苷酸序列的相似性可使用下列unix命令行参数检测bl2seq-i核苷酸seql-j核苷酸seq2-FF-ptblastx参数-FF关闭过滤低复杂性部分。参数-p为成对序列选择合适的算法。该程序发现序列之间的相似性区域，且对于每个这种区域报告"E值"，其是一个人能在含有随机序列的固定参考大小的数据库中偶然地预期见到这种匹配次数(times)的预测数目。这个数据库的大小在bl2seq程序中缺省设置。对于比1小得多的小E值而言，E值约是这种随机匹配的概率。当与任何一种经明确鉴定过的序列进行比较时，变体多核苷酸序列优选显示其E值小于lx10—6，更优选小于lx10—9，更优选小于lxl(T12，更优选小于lx10—15，更优选小于lxl(T18.更优选小于lxl0—21，更优选小于Ixl0—3Q更优选小于lxl0—4().更优选小于lxl0—5Q,更优选小于1x10—6Q更优选小于lxlO—7(),更优选小于lxl(T8Q更优选小于lxl0^且最优选小于Ixl0-1(K)。另外，在严紧条件下，本发明所述的变体多核苷酸与特定的多核苷酸序列或其互补序列杂交。术语"在严紧条件下杂交"和与其语法意义相同的术语是指在限定温度和盐浓度的条件下，多核苷酸分子与靶多核苷酸分子(如固定在DNA或RNA印迹上的靶多核苷酸分子，如Southern印迹或Northern印迹)杂交的能力。在严紧杂交条件下杂交的能力能通过最初在缺乏严紧性的条件下杂交，然后将严紧性增加到所需的严紧性而确定。就长度上在约100个碱基以上的多核苷酸分子而言，典型的严紧性杂交条件是低于天然双螺旋的熔解温度(Tm)，不超过25至30。C(例如10°C)(—般见Sambrook等人Eds,1987，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress;Ausubel等人，1987,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishing)。对于约100个碱基以上的多核苷酸分子的Tm能通过公式Tm=81.5+0.41%(G+C-log(Na+)(Sambrook等人，Eds,1987，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress;Bolton禾口McCarthy,1962，PNAS84:1390)计算得出。长度100个碱基以上多核苷酸典型的严紧性条件是如下的杂交条件以6XSSC，0.2%SDS溶液预洗；于65°C杂交，6XSSC，0.2%SDS过夜；接着在IXSSC，0.1%SDS于65°C冲洗两次，每次30分钟，和在0.2XSSC,0.1%SDS于65。C冲洗两次，每次30分钟。就长度在100碱基以下的多核苷酸分子而言，示例性严紧性杂交条件是低于Tm5至10°C。平均而言，长度在100bp以下的多核苷酸分子的Tm约下降(500/寡核苷酸长度)。C。就已知是肽核酸(PNA)的DNA拟似体(Nielsen等人，Science.1991Dec6;254(5037):1497-500)而言，其Tm值高于DNA-DNA或DNA-RNA杂交分子的Tm值，且能使用Giesen等人所述的公式来计算(Giesen等人，NucleicAcidsRes.1998Nov1;26(21):5004-6)。长度在100碱基以下的DNA-PNA杂交的示例性严紧性杂交条件是低于Tm5至10°C。本发明所述的变体多核苷酸不仅包含区别于本发明所述序列的多核苷酸，还包含作为遗传密码的简并性结果，编码与本发明所述多核苷酸编码的多肽具有相似活性的多肽的多核苷酸。不改变多肽氨基酸序列的序列改变是"沉默变异"。除了ATG(甲硫氨酸)和TGG(色氨酸)，可通过本领域公知技术改变对于同一氨基酸的其他密码子，例如为了在特定宿主生物体中优化表达密码子。本发明还包括导致在其编码的多肽序列上一个或几个氨基酸的保守性取代，而未显著改变其生物学活性的多核苷酸序列的改变。本领域技术人员应了解形成表型沉默的氨基酸取代的方法(见例如Bowie等人，1990，Science247,1306)。由于在其编码的多肽序列上的沉默变异和保守性取代而产生的变体多核苷酸可使用从NCBI(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开得到的BLAST的程序组(version2.2.5[Nov2002])中的bl2s叫程序(version2.2.5[Nov2002])经以前描述过的tblastx算法而确定。本发明所述的变体多核苷酸作为GDP-L-半乳糖脒基转移酶的功能可通过如在实施例部分所述的例如通过这种序列在细菌中的表达，并检测其编码的蛋白质的活性而评价。变体的功能还可通过其改变植物中的GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性或抗坏血酸含量的能力而检测，该方法在本文的实施例部分也做了描述。36本发明所述的变体多核苷酸作为GDP-D-甘露糖差向异构酶的功能可通过如在实施例部分所述的例如通过这种序列在细菌中的表达，并检测其编码的蛋白质的活性而评价。变体的功能还可通过其改变植物中的GDP-D-甘露糖差向异构酶活性或抗坏血酸含量的能力而检测，该方法在本文的实施例部分也做了描述。多厳沐术语"变体"是指包含天然存在的，重组的和合成产生的多肽的多肽。变体多肽的序列与本发明所述序列优选显示出至少50%，更优选至少51%，更优选至少52%，更优选至少53%，更优选至少54%，更优选至少55%，更优选至少56%，更优选至少57%，更优选至少58%，更优选至少59%，更优选至少60%，更优选至少61%，更优选至少62%，更优选至少63%，更优选至少64%，更优选至少65%，更优选至少66%，更优选至少67%，更优选至少68%，更优选至少69%，更优选至少70%，更优选至少71%，更优选至少72%，更优选至少73%，更优选至少74%，更优选至少75%，更优选至少76%,更优选至少77%，更优选至少78%，更优选至少79%，更优选至少80%，更优选至少81%，更优选至少82%，更优选至少83%，更优选至少84%,更优选至少85%，更优选至少86%，更优选至少87%，更优选至少88%，更优选至少89%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，更优选至少93%，更优选至少94%，更优选至少95%，更优选至少96%,更优选至少97%，更优选至少98%，和最优选至少99%的同一性。同一性经本发明所述多肽的至少20个氨基酸位置，优选至少50个氨基酸位置，更优选至少100个氨基酸位置，和最优选经全长的比较窗口而发现。能通过下列方式确定多肽序列的同一性。将目标多肽序列与候选多肽序列使用BLASTP(来自BLAST程序组，version2.2.5[Nov2002])在bl2seq中进行比较，可公开从NCBI(ftp:〃ftp.ncbi.nih,gov/blast/)得到bl2seq。除应关闭过滤低复杂性区域外，使用bl2seq的缺省参数。多肽序列同一性还可使用全面序列比对程序计算候选和目标多核苷酸序列之间重叠部分的全长而得出。上文讨论过的EMBOSS-needle(从http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/可得到)禾卩GAP(Huang,X.(1994)OnGlobalSequenceAlignment.ComputerApplicationsintheBiosciences10,227-235.)也是计算多肽序列同一性合适的全面序列比对程序。计算多肽％序列同一性的优选的方法是基于使用CkistalX将待比较序列进行比对(Jeanmougin等人，1998,7>ew&历oc/e肌Sd.23，403-5.)。本发明所述的多肽变体还包含那些与一个或多个经明确鉴定过的序列表现出相似性的变体，所述的经明确鉴定过的序列可能保存那些序列的功能等价性，和那些不能合理地预测是随机出现的变体。这种序列相对于多肽的相似性可使用公开可得到的来自NCBI(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blast/)BLAST程序组(version2.2.5[Nov2002])的bl2seq程序确定。多肽序列的相似性可使用下列unix命令行参数检测bl2seq—i肽seql-j肽seq2-FF—pblastp当与任何一种经明确鉴定过的序列进行比较时，变体多肽序列优选地显示出lxlO《以下，更优选lxlO"以下，更优选lxl(T12以下，更优选lxl(T15以下，更优选lx10—18以下，更优选lxl(T21以下，更优选lxlO^以下，更优选lxlO"^以下，更优选1x10—5()以下，更优选lxlO—w以下，更优选lxlO^以下，更优选lx10—8()以下，更优选lxl(T9()以下和最优选1x10—1Qe以下的E值。参数-FF关闭过滤低复杂性部分。参数-p为成对序列选择合适的算法。该程序发现序列之间的相似性区域，且对于每个这种区域报告"E值"，其是，一个人能在含有随机序列的固定参考大小的数据库中偶然地预期见到这种匹配次数(times)的预测数目。对于比1小得多的小E值而言，这约是这种随机匹配的概率。本发明还包括不显著改变其生物学活性，保守性取代在所述多肽序列的一个或几个氨基酸。本领域技术人员应了解形成表型沉默的氨基酸取代的方法(见例如Bowie等人，19卯，Science247,1306)。多肽变体作为GDP-L-半乳糖脒基转移酶的功能可通过在本文的实施例部分描述的方法而评价。多肽变体作为GDP-D-甘露糖差向异构酶的功能可通过在本文的实施例部分描述的方法而评价。賴達体、载沐J真成分术语"遗传构建体"是指一种多核苷酸分子，通常为双链DNA，其有插入其中的另一种多核苷酸分子(插入的多核苷酸分子)，如，但不限于cDNA分子。遗传构建体可含有必要的元件，该元件使插入的多核苷酸分子转录，并且可选地，将转录本翻译成多肽。插入的多核苷酸分子可来源于宿主细胞，或可来源于不同的细胞或生物体和/或可是重组的多核苷酸。一旦进入宿主细胞内，遗传构建体可整合进入宿主的染色体DNA中。遗传构建体可连接到载体上。术语"载体"是指一种多核苷酸分子，其通常是双链DNA，其用于将遗传构建体转运进入宿主细胞。载体可能够在至少一个另一种宿主系统(如大肠杆菌(￡.co//.))中复制。术语"表达构建体"是指一种遗传构建体，其包括使插入的多核苷酸分子转录的，并且可选地使转录本翻译成多肽的必要元件。表达构建体典型地在其5'至3'方向包含a)在宿主细胞中有功能的启动子，在宿主细胞中可以转化构建体，b)待表达的多核苷酸，和c)在宿主细胞中有功能的终止子，在宿主细胞中可以转化构建体。术语"编码区"或"开放阅读框"(ORF)是指基因组DNA序列或cDNA序列的正义链，其能够在合适的调控序列控制下，产生转录产物和/或多肽。通过5'翻译起始密码子和3'翻译终止密码子的存在来鉴定编码序列。当插入遗传构建体中时，当将其与启动子和终止子序列可操作性地连接时，能表达"编码序列"。"可操作性地连接"意味着将待表达的序列置于包括启动子、组织特异性调控元件、瞬时调控元件，增强子，抑制子和终止子的调控元件的控制之下。术语"非编码区"是指非翻译序列，其在翻译起始位点的上游和在翻译终止位点的下游。这些序列还分别指5'UTR和3'UTR。这些区域包括转录起始和终止和翻译效率调控所需的元件。终止子是终止转录的序列，并且发现其在翻译序列的下游的基因3'非翻译末端。终止子是mRNA稳定性的重要决定子，且在某些情况中被发现具有空间调控功能。术语"启动子"是指在编码区上游的非转录的顺式调控元件，其调控基因转录。启动子包含顺式起始元件，其指明转录起始位点和保守盒如TATA盒和与转录因子结合的基序。"转基因"是取自一种生物体，并通过转化引入不同生物体中的多核苷酸。转基因可来源于与转基因被引入的生物体相同的物种或不同的物种。"转基因植物"是指通过遗传操作或转化而含有新的遗传物质的植物。新的遗传物质可来源于与所产生的转基因植物相同的物种或不同的物种。"插入重复"是重复的序列，在该重复序列的第二部分是在互补链上，如(5')GATCTA.......TAGATC(3，)(3，)CTAGAT.......ATCTAG(5，)。通读转录将产生转录本，其进行互补性碱基配对形成茎环结构，假如在重复区域之间有3-5bp空间的话。术语本发明所述的多核苷酸或多肽的术语"改变表达"和"表达改变"旨在包含这种情况修饰与本发明所述的多核苷酸对应的基因组DNA，以至于改变本发明所述的多核苷酸或多肽的表达。基因组DNA的修饰可通过遗传转化或本领域已知引入突变的其他方法。"表达改变"能与信使RNA和/或产生的多肽的量的增加或减少相关，且还可由于多核苷酸和所产生多肽的序列改变而导致多肽活性改变。本申请人己经鉴定出编码新型多肽(分别是SEQIDNO:l至7)的新型多核苷酸(SEQIDNO:14至20)，该多肽具有GDP-L-半乳糖脒基转移酶(也称作GDP-L-半乳糖磷酸化酶)活性。本申请人还表明另外已知的但是未经鉴定的，具有以前未知活性的序列(分别编码SEQIDNO:8至11的SEQIDNO:21至24的多核苷酸)，也是GDP-L-半乳糖脒基转移酶序列。本申请人已表明，所有公开的多肽序列(SEQIDNO:1至11)显示出显著的序列保守性，且彼此是变体。本申请人还已经鉴定出两个共有多肽序列(consensuspolyp印tides叫uence)基序(SEQIDNO:12和13)，这两种基序在所有的GDP-L-半乳糖脒基转移酶序列中都存在。相似地，本申请人已经显示出所有公开的多核苷酸序列(SEQIDNO:14至24)显示出显著的序列保守性，且彼此是变体。本发明提供遗传构建体、载体和含有该多核苷酸序列的植物。本发明还提供包含本发明所述的遗传构建体和载体的植物。本发明提供相对于合适的对照植物，其GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性改变的植物，和相对于合适的对照植物，其抗坏血酸含量改变的植物。本发明提供GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性增加和抗坏血酸含量增加的植物。本发明还提供制备这种植物的方法和选择这种植物的方法。本发明还提供鉴定除草剂化合物的方法，该除草剂化合物抑制本发明所述的GDP-L-半乳糖脒基转移酶多肽的活性。合适的对照植物包括相同物种的非转化植物或变种或以对照构建体转化的植物。合适的对照植物不包括具有突变的植物，所述突变导致的改变如GDP-L-半乳糖脒基转移酶含量下降，GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性下降或抗坏血酸含量下降。本申请人还鉴定出编码具有GDP-D-甘露糖差向异构酶活性的新型多肽(分别是SEQIDNO:25至27)的新型多核苷酸(SEQIDNO:38至40)。本申请人已表明所有多肽序列(SEQIDNO:25至35)公开的差向异构酶显示出显著的序列保守性，且彼此是变体。本申请人还已经鉴定出两个共有多肽序列基序(SEQIDNO:36和37)，这两种基序在所有的GDP-D-甘露糖差向异构酶序列中都存在。相似地，本申请人已表明所有公开的差向异构酶的多核苷酸序列(SEQIDNO:38至48)显示出显著的序列保守性，且彼此是变体。本发明提供含有新型多核苷酸序列(SEQIDNO:38至40)或编码新型多肽序列(SEQIDNO:25至27)的序列的遗传构建体、载体和植物。本发明还提供包含本发明所述的遗传构建体和载体的植物。本发明提供相对于合适的对照植物，其GDP-D-甘露糖差向异构酶活性改变的植物，和相对于合适的对照植物，其抗坏血酸含量改变的植物。本发明提供GDP-D-甘露糖差向异构酶活性增加和抗坏血酸含量增加的植物。本发明还提供制备这种植物的方法和选择这种植物的方法。本发明还提供鉴定除草剂化合物的方法，该除草剂化合物抑制本发明所述的GDP-D-甘露糖差向异构酶多肽的活性。合适的对照植物包括相同物种的非转化植物或变种或以对照构建体转化的植物。此外，本申请人已表明GDP-D-甘露糖差向异构酶和GDP-L-半乳糖脒基转移酶在植物中的联合表达导致植物中抗坏血酸含量增加，其大于任一种酶单独表达时的量。此外，本申请人已表明当植物细胞或植物中这两种酶过表达时，存在协同作用。当这两种酶一同在植物中过表达时，抗坏血酸的增加程度大于过表达一种酶所导致的抗坏血酸的增加程度加上过表达另一种酶所导致的抗坏血酸的增加程度之和。本发明提供制备基于这种联合表达的，相对于对照植物，抗坏血酸增加的植物的方法。本发明提供通过这种方法制备的植物。本发明还提供转化差向异构酶和转移酶序列的植物。分麟縱錄微游膽本发明所述的多核苷酸分子能通过使用本领域普通技术人员已知的各种技术来分离。通过举例的方式，这种多肽能通过使用多聚酶链式反应(PCR)分离(见Mullis等人，Eds.1994ThePolymeraseChainReaction,Birkhauser,作为参考并入本文)。本发明所述的多肽能使用引物进行扩增，该引物如本文所限定，其来源于本发明所述的多核苷酸序列。分离本发明所述的多核苷酸的另外方法包括使用全部或部分的具有文中作为杂交探针使用的序列的多肽。能使用标记的多核苷酸探针与固定在固相支持物(如硝酸纤维素膜或尼龙膜)上的多核苷酸杂交的技术来筛选基因组文库或cDNA文库。示例性杂交和洗膜条件是于65。C在5.0XSSC，0.5%十二烷基磺酸钠，IXDenhardt氏溶液中杂交20小时；在1.0XSSC，P/。(w/v)十二烷基磺酸钠洗膜(于55°C，洗三次，每次20分钟)，且可选地在0.5XSSC，l%(w/v)十二烷基磺酸钠于60°C洗膜一次(20分钟)。可选的进一步洗膜(20分钟)的方法能在0.1XSSC，l%(w/v)十二烷基磺酸钠于60°C条件下进行。本发明所述的多核苷酸片段可通过本领域熟知的技术制备，这些技术如限制性核酸内切酶消化、寡核苷酸合成和PCR扩增。在本领域所熟知的方法中可使用部分多核苷酸序列来鉴定相应的全长多核苷酸序列。这种方法包括基于PCR的方法、5'RACE(FrohmanMA，1993,MethodsEnzymol.218:340-56)和基于杂交的方法、基于计算机/数据库的方法。另外，通过示例性方式，反向PCR可获得本文公开的多核苷酸序列侧翼的未知序列，该序列起始于基于已知区域的引物(Triglia等人，1998,M/c/e/c爿c/Aie;y16,8186，通过引用并入本文)。该方法用几种限制性酶在基因的已知区域内产生合适的片段。然后将片段通过分子内连接环形化，并作为PCR模板。从已知区域设计分枝引物(Divergentprimer)。为了物理性装配全长的克隆，能使用标准的分子生物学方法(Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987)。当从特定物种制备转基因植物时，以序列或来源于该物种的序列转化这种植物可以是有益的。这种益处可缓解关于物种间交叉转化产生转基因生物体的公众的担心。此外，当基因的下调是所期望的结果时，有必要利用与植物中序列相同(或至少高度相似)的序列，对于该植物，减少表达是期望的。为了其他原因中的这些原因，期望能在不同的植物物种中鉴定和分离特定基因的直系同源物。可通过所述的方法鉴定变体(包括直系同源物)。鉴定鄉游方法激潘方兹可使用基于PCR的方法鉴定变体多肽((Mullis等人，Eds.1994ThePolymeraseChainReaction,Birkhauser)。通常，引物的多核苷酸序列可以基于编码相应氨基酸序列的保守区序列，所述的引物用于通过PCR扩增本发明所述多核苷酸分子的变体。另外，可使用本领域技术人员所熟知的文库筛选方法(Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987)。当鉴定探针序列的变体时，杂交和/或洗的严紧性通常相对于当寻找完全序列匹配(exactsequencematch)的严紧性下降。也可通过物理方法鉴定多肽变体，例如，通过使用抗本发明所述多肽的抗体筛选表达文库(Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd-ColdSpringHarborPress,1987)或在这种抗体的帮助下从天然来源中鉴定该多肽。基晋,赫滩本发明所述的变体序列，包括多核苷酸和多肽变体，还可通过基于计算机的方法进行鉴定，所述的方法是本领域技术人员所熟知的，该方法使用公共结构域比对算法和序列相似性査找工具查找序列数据库(公共结构域数据库包括Genbank、EMBL、Swiss-Prot、PIR和其它)(见例如NucleicAcidsRes.29:1-10和11-16,2001)，其是在线资源的例子。相似性查找寻回(retrieve)和比对靶序列以与待分析的序列(即查询序列(querysequence))进行比较。序列比较算法使用分值矩阵(scoringmatrix)赋予每次比对一个全面的分值。用于在序列数据库中鉴定变体的示例性程序族是BLAST程序组(version2.2.5[Nov2002])，其包括BLASTN,BLASTP，BLASTX，tBLASTN和tBLASTX，这些软件是公众可从(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blastA)或从生物技术信息国家中心(NCBI)，国家医学图书馆(Building38A,Room8N805,Bethesda,MD20894USA.)得到。NCBI服务器还提供使用这些程序筛选大量公众可得到的序列数据库的工具。BLASTN将核苷酸查寻序列与核苷酸序列数据库进行比较。BLASTP将氨基酸查询序列与蛋白质序列数据库进行比较。BLASTX将以所有阅读框翻译的核苷酸查询序列与蛋白质序列数据库进行比较。tBLASTN将蛋白质查询序列与以所有阅读框动态翻译的核苷酸序列数据库进行比较。tBLASTX将核苷酸查询序列的六种框翻译产物与核苷酸序列数据库的六种框翻译产物进行比较。BLAST程序可使用缺省参数或可因需要而改变参数来改进筛选。出版物(Altschul等人，NucleicAcidsRes.25:3389-3402，1997)描述了包括BLASTN，BLASTP和BLASTX的BLAST家族算法的使用。当通过BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或相似的算法产生的查寻序列，通过该査询序列"命中"(hit)—个或多个数据库序列时，对命中序列的相似部分进行比对和鉴定。以相似程度和序列重叠的长度的顺序排列命中序列。数据库序列的命中序列一般代表与仅仅一部分查寻序列的序列长度的重叠部分。对于比对，BLASTN，BLASTP，BLASTX，tBLASTN和tBLASTX算法还产生"预期"值。预期值(E)提示，当查找含有随机连续序列的相同大小的数据库时，一个人能"预期"偶然发现的命中序列的数目。预期值用作显著性的阈值以确定对于数据库的命中序列是否提示真实的相似性。例如，指定多核苷酸的E值是O.l，命中解释为在被筛选数据库大小的数据库中，在具有相似分值的序列的比对部分，一个人可预期只经偶然发现O.l匹配。对于在比对和匹配部分，E值是0.01或更低的序列，使用BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN或tBLASTX算法在那个数据库中偶然发现匹配的可能性是1%或更低。成组相关序列的多重序列比对能用CLUSTALW进行(Thompson,J.D.,Higgins:D.G.和Gibson,T丄(1994)CLUSTALW:通过序列加权(sequenceweighting),位置特异性空位罚分和加权矩阵选择改进进展性多重序列比对的敏感性。NucleicAcidsResearch,22:4673-4680,http:〃www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html)或T-COFFEE(CedricNotredame,DesmondG.Higgins，JaapHeringa，T-Coffee:Anovelmethodforfast禾卩accuratemultiple序歹llalignment,J.Mol.Biol.(2000)302:205-217)或PILEUP，其使用进展性成对比对(FengandDoolittle,1987,J.Mol.Evol.25,351)。模式识别应用软件可用于发现基序或特征序列。例如，MEME(基序引出的多重Em)在成组序列中发现的基序或特征序列，且MAST(基序比对和查寻工具)使用这些基序鉴定查寻序列上的相似或相同基序。MAST结果以具有合适统计学数据的一系列比对和被发现基序的可视概况提供。MEME和MAST是在加利福尼亚大学(圣迭哥)开发出来。PROSITE(Bairoch和Bucher，1994,NucleicAcidsRes.22,3583;Hofmann等人,1999,NucleicAcidsRes.27，215)是一种鉴定从基因组或cDNA序列翻译过来的未鉴定蛋白质功能的方法。PROSITE数据库(www.expasy.org/prosite)含有生物学重要模式和图谱，且其设计成能以合适的计算机工具将新序列分配到已知蛋白质家族中或确定序列中存在哪个已知结构域(Falquet等人，2002，NucleicAcidsRes.30,235)。Proseaxch是能以给定的序列模式或特征来査找SWISS-PROT和EMBL数据库的工具。分庸多詹減本发明所述的多肽，包括变体多肽，可使用本领域所熟知的肽合成方法制备，如使用固相技术的直接肽合成(例如Stewart等人，1969,inSolid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo,SanFranciscoCalifornia,orautomatedsynthesis,forexamplesusinganAppliedBiosystems431APeptideSynthesizer(FosterCity,California)。多肽的突变形式也可在这种合成过程中制备。本发明所述多肽和变体多肽也可从天然来源中使用各种本领域所熟知的各种技术纯化而来(例如Deutscher,1990,Ed，MethodsinEnzymology,Vol.182,Gw/tfeto另外，本发明所述的多肽和变体多肽可在合适的宿主细胞中重组表达并从以下将讨论的细胞中分离出来。劍备/爐沐織沐游膽本发明所述的遗传构建体包含一条或多条本发明所述的多核苷酸序列和/或编码本发明所述多肽的多核苷酸，且可用于转化例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物体。本发明所述的遗传构建体旨在包括本文所定义的表达构建体。制备和使用遗传构建体和载体的方法是本领域所熟知的(且一般见Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987;Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishing,1987所述)。縱船多提舰辦银纖沐游存主银蕭膽本发明提供包含本发明所述的遗传构建体或载体的宿主细胞。宿主细胞可来源于例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物体。在本领域所熟知的方法中，本发明所述的包含遗传构建体如表达构建体的宿主细胞，对于重组制备本发明所述的多肽是有用的(例如Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987;Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishing,1987)。这些方、法可包含将宿主细胞在合适的培养基中在适于或有益于表达本发明所述多肽的条件下培养。表达的重组多肽，其可选的可分泌至培养物中，然后可将其从培养基、宿主细胞或培养的培养基中采用本领域所熟知的方法分离(例如Deutscher，Ed，19卯,MethodsinEnzymology,Vol182,GuidetoProteinPurification)。劍备包舒键沐滅伴爐激細維赫膽本发明进一步提供包含本发明所述的遗传构建体的植物细胞和经修饰改变本发明所述多核苷酸或多肽表达的植物细胞。包含这种细胞的植物还形成本发明的一个方面。GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向异构酶和/或抗坏血酸含量的改变也可在植物中通过本发明所述的方法来改变。这些方法可包含本发明所述的构建体转化植物细胞和植物，该构建体被设计成用于在这种植物细胞或植物中改变调节GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向异构酶活性和/或抗坏血酸含量的多核苷酸或多肽的表达。这种方法还包括以本发明所述的构建体和一种或多种其它构建体联合转化植物细胞和植物，所述其它构建体被设计用于在这种植物细胞和植物中改变调节GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向异构酶活性和/或抗坏血酸含量的一种或多种多核苷酸或多肽的表达。以多肽转化植物细胞、植物及其各部分的方法如文献所述(Draper等人，1988,PlantGeneticTransformationandGeneExpression.ALaboratoryManual.BlackwellSci.Pub.Oxford,p.365;Potrykus禾口Spangenburg,1995,GeneTransfertoPlants.Springer陽Verlag，Berlin.;禾口Gelvin等人,1993,PlantMolecularBiol.Manual.Kl丽erAcad.Pub.Dordrecht.Areviewoftransgenicplants,includingtransformationtechniques,isprovidedinGalun禾口Breiman,1997,TransgenicPlants.ImperialCollegePress,London.)。潜激遗传鮮游減可得到多种植物转化策略(例如Birch,1997,AnnRevPlantPhysPlantMolBiol,48，297，HellensRP等人(2000)PlantMolBiol42:819-32,HellensR等人PlantMethl:13)。例如，策略可设计成在植物细胞、器官中和/或在多核苷酸/多肽在是正常表达的特定发育阶段增加其表达，或设计成在细胞、组织、器官中和/或在其是不正常表达的特定发育阶段异位表达所述多核苷酸/多肽。表达的多核苷酸/多肽可来源于被转化的植物物种，或可来源于不同的植物物种。转化策略可设计成在植物细胞、器官中或在多核苷酸/多肽是正常表达的特定的发育阶段减少其表达。这些策略称为基因沉默策略。用于在转基因植物中表达基因的遗传构建体通常包括驱动一个或多个克隆的多核苷酸表达的启动子，终止子和可选择的用于检测在转基因植物中遗传构建体存在的标记序列。适合用于本发明所述的构建体的启动子在单子叶植物或双子叶植物的细胞、组织或器官中是功能性的，且其包括细胞特异性、组织特异性或器官特异性的启动子，细胞周期特异性启动子，瞬时启动子，可诱导启动子，在大多数植物组织中有活性的组成性启动子和重组启动子。启动子的选择取决于所期望的克隆的多核苷酸的时间和空间表达。启动子可是那些正常情况下与目的转基因相关的启动子，或是来源于其它植物、病毒和植物致病性细菌和真菌的基因的启动子。本领域技术人员不需额外的实验就能选择适于在使用遗传构建体来修饰和调节植物性状中使用的启动子，所述的遗传构建体包含本发明所述的多核苷酸序列。组成性植物启动子的例子包括CaMV35S启动子，胆脂碱合酶(nopalinesynthase)启动子和章鱼(肉)碱合酶(octopinesynthase)启动子和玉米的Ubi1启动子。在特定组织中具有活性的响应于内部的发育信号或外部的非生物的或生物的应激的植物启动子见科学文献所描述，例如，WO02/00894描述了示例性的启动子，通过参考并入本文。在转化遗传因构建体的植物中普遍使用的示例性的终止子包括，例如，花椰菜嵌合体(cauliflowermosaic)病毒(CaMV)35S终止子，根瘤病土壤杆菌"gra&"en'ww,w附e/ac/era)胆脂碱合酶或章鱼(肉)碱合酶终止子，玉米玉蜀黍蛋白(Zeawqyszein)基因终止子水稻(Oyzas加Va)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶终止子和土豆(5Wa"wm^6eroswm)PI-II终止子。在植物转化中普遍使用的选择性的标记包括新霉素磷酸转移酶II基因(NPT11)，其赋予植物卡那霉素抗性，aadA基因，其赋予植物大观霉素(spectinomycin)和链霉素抗性，膦丝菌素(phosphinothricin)乙酰基转移酶(6argene)赋予Ignite(AgrEvo)和巴斯塔(Basta)(烟酸己可碱(Hoechst))抗性，以及潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)赋予潮霉素抗性。还注意到包含报告基因的遗传构建体的用途，遗传构建体包含的报告基因编码表达对于宿主是外源活性，通常是酶活性，和/或可见信号(例如荧光素酶、GUS、GFP)的序列，所述的报告基因可用作在植物和植物组织中进行启动子表达分析。报告基因的文献综述见于Herrera-Estrella等人，1993,Nature303，209，和Schrott，1995,In:GeneTransfertoPlants(Potrykus，T.，Spangenberg.Eds)SpringerVerlag.Berline,pp.325-336。关于基因沉默策略，人们关注基因本身或影响编码多肽表达的调节元件。"调节元件"是在最广泛的可能的意义上使用，并包括与目的基因接触的其它基因。设计减少或沉默本发明所述的多核苷酸/多肽表达的遗传构建体可包括本发明所述多核苷酸的反义拷贝。在这种构建体内，多核苷酸被置于与启动子和终止子反义的方向上。"反义"多核苷酸通过使多核苷酸或多核苷酸的片段倒置而获得，以使产生的转录本与该基因的mRNA转录本互补，例如，5'GATCTA3，(编码链)3'CTAGAT5，(反义链)3'CUAGAU5，mRNA5'GAUCUCG3，反义RNA设计用于基因沉默的遗传构建体还包括倒置重复序列。"倒置重复序列"是其中重复的第二半部分是在互补链上的重复序列，例如5，-GATCTA.........TAGATC-3'3，-CTAGAT.........ATCTAG-5，形成的转录本可进行互补性碱基配对以形成茎环结构。通常，需要重复区域间至少3-5bp的空间来形成茎环构型。另一种沉默方法包括使用靶向等同于miRNA的转录本的小反义RNA(Llave等人，2002,Science297,2053)。使用这种与本发明所述多核苷酸对应的小反义RNA是受关注的。本文所使用的术语"遗传构建体"还包括小的反义RNA和影响基因沉默的其它这种多肽。以本文所定义的表达构建体进行转化也可通过称之为正义抑制的过程导致基因沉默(例如Napoli等人,1990,PlantCell2,279;deCarvalhoNiebel等人，1995，PlantCell,7,347)。在某些情况下，正义抑制可包括全部或部分编码序列过表达，还可包括基因的非编码区的表达，基因的非编码区有如内含子或5'或3'非翻译区(UTR)。嵌合的部分正义构建体能用于协调地使多个基因沉默(Abbott等人,2002,PlantPhysiol.128(3):844-53;Jones等人，1998,Planta204:499-505)。使用这种正义抑制策略来使本发明所述多核苷酸的表达沉默也是受到关注的。插在设计用于基因沉默的遗传构建体中的多核苷酸可对应于编码序列和/或非编码序列，如启动子和/或内含子和/或5'或3'UTR序列或对应的基因。其它基因沉默的策略包括显性抑制(dominantnegative)方法和使用核酶构建体(Mclntyre,1996，TransgenicRes,5,257)。转录前沉默可通过基因本身或其调节元件的突变而产生。这种突变可包括点突变，移码，插入，缺失和取代。下列是能用于遗传转化下列植物物种的公开遗传转化规程的代表性出版物Rice(Alam等人，1999,PlantCellRep.18，572);apple(Yao等人，1995，PlantCellReports14,407-412);maize(USPatentSerialNos.5,177,010和5,981,840);wheat(Ortiz等人，1996，PlantCellRep.15,1996,877);tomato(USPatentSerialNo.5,159,135);potato(Kumar等人，1996PlantJ.9,:821);cassava(Li等人，1996NatBiotechnology14,736);lettuce(Michelmore等人，1987，PlantCellRep.6,439);tobacco(Horsch等人，1985,Science227,1229);cotton(USPatentSerialNos.5,846,797and5,004,863);grasses(USPatentNos.5,187，073and6.020，539);peppermint(Niu等人，1998，PlantCellRep.17,165);citrusplants(Pena等人，1995,PlantSci.104,183);caraway(Krens等人，1997，PlantCellRep,17，39);banana(USPatentSerialNo.5，792,935);soybean(USPatentNos.5，416,011;5，569,834;5,824，877;5,563,04455and5,968，830);pineapple(USPatentSerialNo.5,952,543);poplar(USPatentNo.4，795，855);monocotsingeneral(USPatentNos.5，591,616and6,037，522);brassica(USPatentNos.5,188，958;5,463，174and5,750，871);cereals(USPatentNo.6,074,877);pear(Matsuda等人，2005,PlantCellRep.24(1):45-51);Prunus(Ramesh等人，2006PlantCellRep.25(8):821-8;Song和Sink2005PlantCellRep.2006;25(2):117-23;GonzalezPadilla等人，2003PlantCellRep.22(1):38-45);strawberry(Oosumi等人，2006Planta.223(6):1219-30;Folta等人，2006PlantaApr14;PMID:16614818),rose(Li等人，2003),Rubus(Graham等人，1995MethodsMolBiol.1995;44:129-33),tomato(Dan等人，2006,PlantCellReportsV25:432-441),apple(Yao等人，1995，户/朋fCe〃14,407~412)和Actinidiaeriantha(Wang等人，2006，PlantCellRep.25,5:425-31)。其它物种的转化也受本发明的关注。可在科学文献上得到合适的方法和规程。可使用本领域已知的几种进一步方法来改变本发明所述的核苷酸和/或多肽的表达。这些方法包括但不限于Tilling(Till等人，2003,MethodsMolBiol,2%,205)，所谓的"Deleta基因"技术(Li等人，2001，PlantJournal27(3),235)和使用人工转录因子，如合成锌指转录因子(例如Jouvenot等人，2003，GeneTherapy10,513)。此外，靶向特定多肽的抗体或其片段也可在植物中表达来调节那种多肽的活性(Jobling等人，2003,Nat.Biotechnol.,21(1)，35)。还可使用转座子示踪方法。此夕卜，与本发明所述多肽相互作用的肽可通过如相显示(phase-display)(Dyax公司)的技术来鉴定。这种相互作用的肽可在植物中表达或应用于植物以影响本发明所述多肽的活性。改变本发明所述核苷酸和/或多肽表达的上述方法中每一种方法的使用受到特别关注。遂激雄減还提供用于选择GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向异构酶活性和/或抗坏血酸含量改变的植物的方法。这些方法包括测试用于改变本发明所述多核苷酸或多肽、植物表达的植物。这些方法可用在年幼或早期发育阶段，此时GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向异构酶活性和/或抗坏血酸含量的改变可无需容易地检测到。多核苷酸的表达，如信使RNA，经常用作相应的多肽表达的提示。检测多核苷酸表达的示例性方法包括但不限于Northern分析，RT-PCR和斑点印迹分析(Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987)。本发明所述的多核苷酸或部分多核苷酸因此在鉴定植物的方法中用作如本文所定义的探针或引物，所述植物具有改变的GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性水平、GDP-D-甘露糖差向异构酶活性水平或抗坏血酸的水平。本发明所述的多核苷酸可用作设计用于鉴定这种植物的杂交实验中的探针，或基于PCR的实验中的引物。另外，可制备抗本发明所述多肽的抗体。制备和使用抗体的方法是本领域的标准方法(见例如Antibodies,ALaboratoryManual,HarlowALane,Eds,ColdSpringHarbourLaboratory,1998)。这种抗体可在检测调节植物花朵大小的多肽表达改变的方法中使用。这些方法可包括ELISA(Kemeny,1991,APracticalGuidetoELISA,NYPergamonPress)和Western分析(Towbin&Gordon,1994,JImmunolMethods,72,313)。这些分析多核苷酸或多肽的表达和选择GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性、GDP-D-甘露糖差向异构酶活性或抗坏血酸含量改变的植物的方法，在传统的育种程序中是有用的，所述程序是设计用来产生GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性、GDP-D-甘露糖差向异构酶活性或抗坏血酸含量改变的变种的。潜激术语"植物"旨在包括整个植物，植物的任一部分，植物的繁殖体和后代。术语"繁殖体"意味可用在生殖或繁殖的(有性生殖或无性生殖的)植物的任一部分，包括种子和插条(cutting)。本发明所述的植物可是种植的，且是自体受精或与不同植物品系交叉受精，且所产生的具有所期望的表型特征的杂交体可被鉴定。可种植两代或更多代以确保目标表型特征稳定维持和继承。由这些标准育种方法得到的植物也形成本发明的一方面。植物中GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性，和/或GDP-D-甘露糖差向异构酶活性，和/或抗坏血酸含量的改变也可通过本发明所述的方法来改变。这些方法可包括以本发明所述的构建体转化植物细胞和植物，所述构建体被设计成用于改变在这种植物细胞和植物中调节GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向异构酶活性和/或抗坏血酸含量的多核苷酸或多肽的表达。这些方法还包括以本发明所述的构建体和其他构建体联合转化植物细胞和植物，所述其他构建体被设计成用于改变在这些植物细胞和植物中调节GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向异构酶活性和/或抗坏血酸含量的一种或多种多核苷酸或多肽的表达。孺肿微蕭就辆湖膽还提供通过从本发明所述的植物中提取抗坏血酸，制备抗坏血酸的方法。可如下从植物中提取抗坏血酸将冰冻组织样品在Cryomill中在液氮温度下研碎成精细的粉末。然后将约200mg冰冻粉末组织用4倍体积的含4mMTCEP(Pierce)的0.5NHC1悬浮，震荡混合20秒，并在40°C在加热块中孵育2小时。在提取溶液中使用TCEP，因其在酸性条件下是比DTT更有效的还原试剂，确保所有维生素C是抗坏血酸的还原形式。提取物在4。C离心，且将20|aL上清液注射进入一个7.8x300mmAminexHPX-87HHPLC柱(BioRad)内。该柱以2.8mMH2S04,0.6mL/min的流速运行，且根据在245nm(滞留时间9.6min)处的吸收来计算抗坏血酸的量，将抗坏血酸(SigmaStLouis)用作标准。通过显示峰在pH5.5被抗坏血酸氧化酶完全降解，验证其为抗坏血酸。该方法可使用本领域技术人员所熟知的方法为了大规模抗坏血酸提取扩大规模。餘輔,遂膽使用本发明所述的方法，可筛选作为候选除草剂的任何化合物。可能被筛选的化合物的例子包括无机的和有机的化合物，如，但不限于氨基酸、肽、蛋白质、核苷酸、核酸、糖轭合物、低聚糖、月旨、醇、硫醇、醛、烷基化物(alkylator)、碳醚、酰肼、肼、酮、腈、胺类、(烃基)磺酰氯、三嗪、哌嗪(piperizine)、磺胺等。优选地，在本发明所述的方法中筛选化合物库。合成和筛选化合物库的方法是本领域技术人员所知的，见例如U.S.专利No.5,463，564;5,574，656;5,684,711;和5,901,069，其内容通过参考被并入。鉴定与这种多肽结合的化合物的方法是已知的，并例如在WO03/077648中有描述。检测本发明所述多肽活性的方法在本文提供的实施例中有描述。广义上讲，本发明还在于在本申请说明书中分别或一起提及或所提示的各部分、原理和特征，和任意两个或多个所述部分、原理或特征的任一种或所有组合，以及在本文提及特定整体的地方，所述整体已知是本发明相关的本领域内的等同物，这种巳知的等同物被认为是作为单独列出弓I入本文。参考下列所附附图可更好地理解本发明，其中图1显示拟南芥序列VTC2与中华猕猴桃"c"m^/a'Hortl6A，序列319998和第二拟南芥U.序列At5g55120的比对。还比对了拟南芥属(Arabidopsis)酶At5gl8200(编码推定的UDP-葡萄糖-己糖-l-磷酸尿苷转移酶(EC-编号2.7.7.12))和未命名的小鼠蛋白质Mm—74150758(该号码是GenBank登录号)。在所有五个序列中相同的比对残基用深灰色显示，相似的残基用浅灰显示。用ClustalX(Jeanmougin等人，1998)伴一些人工调整比对序列。在约250氨基酸残基处鉴定HIT三联序列。图2显示猕猴桃GDP-甘露糖-l-P脒基转移酶、EST319998(SEQIDNO:1/14)对GDP-L-半乳糖的反应。使用在方法中所述的差向异构酶从GDP-D-甘露糖制备GDP-L-半乳糖，且混合物GDP-L-半乳糖的浓度通过HPLC确定。使用连续的成对的分析进行分析，每次分析使用0.029ug酶。甘露糖-l-P浓度是0.93mM和1.87mMMgCl2。其他条件如文中所述。正方形代表反应减去无甘露糖-1-P时的运行背景。三角形代表使用HisTrap纯化表达空PET30a载体的Ecoli提取物(0.006ug)的背景值(时程319998111006.xls)。图3显示酶EST319998(SEQIDNO:1/14)对于潜在的脒基受体的反应。使用连续的成对检测，以不同的脒基受体的无机磷酸(正方形)，无机焦磷酸(圆形)或D-甘露糖-l-P(三角形)浓度进行检测。对于底物磷酸、焦磷酸和D-甘露糖-l隱P，vamax值分别是0.12±0.03，0.032±0.002和0.17±0.009nmolsec"ug-1蛋白质。KM值分别是4.4士2,0.16士0.05和0.11士0.03mM。检测进行三次，具有相似的结果。图4显示瞬时表达的猕猴桃EST319998(SEQIDNO:1)对烟草叶中抗坏血酸含量和酶活性的影响。详见方法部分。白色柱代表叶子中的抗坏血酸浓度(以新鲜重量基础表示)，黑色柱代表GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性(以g蛋白质基础表示)。Ll，L2和L3代表三个被注射的顶端的叶子。标准棒(Errorbar)是均值的标准误差(n-3至6)。图5显示将D-甘露糖-l-磷酸转化为L-半乳糖-l-磷酸的反应。图6显示与At4g26850具有显著相似性的一系列序列的比对。比对使用ClustalX(/)进行。244893_Ac和319998_Ac是中华猕猴桃的EST,24547_Ae和276582_Ae是毛花猕猴桃的EST,82552_Md是苹果的EST,315905—Ms是天女花OfWe6oW/〃(野生酸苹果)的EST,At4g26850是拟南芥的VTC2，和At5g55120也是来自拟南芥的同源物。BT013858—Le是自番茄ayco/7e"/cow^cw/ew加w)进入的GenbankDNA的翻译产物，Osl2g0190000是水稻(水稻)序列。Contig_St是叠连序列(contig)，其由在Genbank中鉴定的95%相同的重叠土豆(So/朋wwft/6emsMWy>(土豆)EST组装而来。图7显示图6中比对的序列之间的同一性％。图8显示上述比对的显示不同物种序列的丛集的无根的序列树。图9显示的多核苷酸编码序列的比对(使用ClustalX)，该多核苷酸编码序列编码图6中比对的多肽序列。图10显示图9中比对的多核苷酸编码序列之间的同一性百分数。图11显示SEQIDNO:25至35的GDP-D-甘露糖差向异构酶游多肽序列的比对。所有四条序列中的相同的比对残基用深灰显示，相似的残基用浅灰显示。序列用ClustalX(Jeanmougin等人，1998)进行比对。图12显示图1中比对的序列之间的序列同一性％。图13显示SEQIDNO:5至8的差向异构酶多核苷酸序列的比对(使用ClustalX)。图14显示SEQIDNO:25至28的差向异构酶的多核苷酸序列之间的同一性%。图15显示烟草叶子中的抗坏血酸作为注射入叶子中的GDP-L-半乳糖脒基转移酶(319998)和差向异构酶(169164)量的函数。烟草被瞬时转化含有任一个这两种基因的土壤杆菌属Ugra6a"e^附入注射前将不同量混合，加入恒定量的含有P19的土壤杆菌属(jgrak^^^w)，且所有混合物的体积达到恒定的水平。约8天后检测抗坏血酸。差向异构酶(A)和转移酶(B)的滴定显示另一种基因的不同水平。图16显示瞬时转化一系列的GDP-L-半乳糖脒基转移酶和差向异构酶构建体的烟草叶子中抗坏血酸水平。图17显示瞬时转化特定的GDP-L-半乳糖脒基转移酶的烟草叶子中抗坏血酸水平。图18显示在GDP-L-半乳糖脒基转移酶319998转化拟南芥属64ra6/tto戸/W品系中卡那霉素抗性的分离(segregations种子种植在卡那霉素平板上，且计算绿色和死亡发芽种子的数目。正确=多拷贝，错误=单拷贝。以粗体书写的数值继续至第二代(表3)。图19显示转化GDP-L-半乳糖脒基转移酶319998的拟南芥属的第二代品系，其在叶子中显示高抗坏血酸的发生率。所有植物经选择均有卡那霉素抗性。在括51号中的数目是均值的标准误差，抗坏血酸(ASC)为mg/100g。图20显示转化GDP-L-半乳糖脒基转移酶319998的拟南芥属64ra6/tfo;w/W的第三代品系，其叶子中显示高抗坏血酸的发生率。所有植物经选择均有卡那霉素抗性。在括号中的数目是均值的标准误差，抗坏血酸(ASC)为mg/100g。图21显示在选择的转化GDP-L-半乳糖脒基转移酶319998的拟南芥属"raWtfo^&J品系中的基因表达和叶子的抗坏血酸浓度。选定品系中的基因表达通过qPCR检测。图22显示稳定转化GDP-L-半乳糖脒基转移酶319998的烟草的抗坏血酸水平和基因表达。使用定性技术进行PCR。图23显示￡co/f中表达的酶的GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性。于20°C，在旧的Victor平板读出器(reader)("旧的"使用0.000254517nmol/F的校正因子将荧光单位转换为纳摩尔)中或在新的Victor3("新的"校正因子是2.6565E-05nmol/F)中进行检测。实施例现在参考下列非限制性实施例，解释本发明。实施例l:一种来自猕猴桃水果的推定的拟南芥(4mW^/w/sAfl//fl"fl)同源物At4g26850的鉴定使用纽西兰园艺和食物研究所所有的猕猴桃(J^m'&fl)EST数据库的At4g26850进行Blast查找，揭示出在超过132,000个EST之中与AT4g26850同源的120个EST。这些EST来源于一系列包括翼瓣、果实、芽和分生组织和叶子的组织。申请人从中华猕猴桃的幼小果实文库中选定EST319998。这两种拟南芥属(Jra^Wo/w^)蛋白质和猕猴桃蛋白质显示出彼此的71%至75%同一性。序列使用ClustalX(ClustalX(Jeanmougin等人，1998)进行比对，如图1所示。实施例2:使用生物信息学分析揭示At4g26850作为GDP-L-半乳糖-脒基转移酶的推定功能微餘基艘拔重复运行PSIBlast(Altschul等人，1997;Schaffer等人，2001)6+次，进一步检测被鉴定基因的注解(annotation)。基序查找用MEME(Bailey和Elkan,1994)用一套基因作为选定输入(At4g26850和HIT成员，包括GalT)进行。通过BLASTp査找编码与未鉴定的拟南芥属基因At4g26850的预期蛋白质序列相似的蛋白质的基因，申请人最初仅发现了也被注解为与At4g26850相似的其他植物基因。然而，进一步在匹配基因列表中的是蛋白质的InterproHIT家族(IPR001310)成员，该蛋白被鉴定为核苷酸结合蛋白质和水解酶。该家族包括二腺苷四磷酸(Ap4A)水解酶和GalT(I类D-半乳糖-l-磷酸尿苷转移酶)(Brenner,2002)。例如，属于这个GalT家族的大鼠基因显示出1E-37的预期值，其与At4g26850的超过364个残基具有30%的同一性和48%的相似性。尽管GalT亚群(也称作interproIPR001937)具有相关基序HXHXQ，然而这些HIT蛋白质通常以基序HXHXH为特征(其中X是疏水氨基酸)。根据结构分析，已经显示出GalT是HIT蛋白家族成员(Brenner等人，1997)。申请人使用PSI-BLAST(Altschul等人，1997;Schaffer等人，2001)细化该査找，且被比对的主要类别是HIT家族成员。例如，重复6次后，第一个非植物的比对序列是人的基因(Genbank34527348)，其具有28%的同一性和47%的相似性(在373个残基中)并且预期值为2E-99。从一系列来自哺乳动物物种的基因中发现相似的比对，所有这些具有<2E-93的E值，描述二腺苷四磷酸(Ap4A)水解酶和其它HIT家族水解酶。在较低的相似性上，申请人观察到一组的ATP腺苷酰转移酶样蛋白(预期〉E-70)。在较高的预期值O1E-10)上，申请人然后发现具有HIT注解的其它基因。申请人然后使用了一个选定的HIT组的interproIPR001310成员组，加AT4g26850、At4g26850禾卩EST319998(见表1)，并使用MEME网站httu:〃meme.sdsc.edu(Bailev和Elkan,1994)查找基序。申请人鉴定出六个显著的基序，这六个显著的基序出现在所有五种植物序列中。出现在四种动物序列中的五种这样的基序和剩余的动物序列具有四种基序(见表1)。这显示这些蛋白质是明确相关的，并属于HIT超家族。表l.在选定范围的猕猴桃est319998的同源物中出现的基序<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>基序1包括诊断模式HxHxQ(HxHxH的)(见图1)。令人感兴趣的是，HIT家族的GaIT亚家族也共有这个HxHxQ模式，尽管不能用这个序列发现共同基序。根据这些生物信息学分析，似乎可能的是负责抗坏血酸突变体FTC2(At4g26850)及其猕猴桃的同源物编码脒基转移酶。实施例3:猕猴桃GDP-L-半乳糖脒基转移酶EST319998和拟南芥At4g26850在大肠杆菌(E"//)中的表达及鉴定酶活性基像,_^厲好,^游袤这将来自中华猕猴桃幼小果实的EST319998和At4g26850中的每个克隆进入pET30A(Novagene,USA)中，检査其在大肠杆菌中的序列和在大肠杆菌中的表达。N-末端His6标签用于纯化该蛋白。平行表达和纯化空载体对照。这些技术基本上是以前已有描述的(Laing等人，2004)。在这项工作的大部分内容中，在5mLHiTrapQFF柱(GEHealthcare)上进一步纯化组氨酸(His)蛋白，两种制备物获得相同的结果。结合酶从来源于美味猕猴桃的枝芽(shootbud)文库的EST中，带有麦芽糖结合蛋白前序列，克隆L-半乳糖脱氢酶(GenBank登录号AAOl8639(EST56121),1.5ug/次分析)，并如前所述进行分析(Laing等人，2004)。从拟南芥"raWtto戸^(At3g02870,3.1ug/次检测)中克隆L-半乳糖-l-磷酸磷酸酶，并如前所述进行分析(Laing等人，2004)。在用氰胺(hydrogencyanamide)处理3天后，从休眠的猕猴桃(Ue//c/0M)芽中克隆GDP-D-甘露糖3'，5'-差向异构酶(198296)，并如所述进行分析(Wolucka等人，2001)。前两种酶就其底物是高度特异性的(Laing等人，2004;Laing等人，2004)。GDP-L-半乳糖(~50%纯，如HPLC和LCMS所显示，其污染有分解产物GDP和L-半乳糖-l-磷酸)和L-半乳糖-l-磷酸购自Glycoteam公司(Hamburg,Germany)。申请人:发现，GDP-L-半乳糖是极其酸性不稳定的，且申请人未试图将其进一步纯化。其他生化试剂购自Sigma公司。體舰.GDP-L-半乳糖-l-磷酸脒基转移酶的检测在20mMTrisCl,pH8.0,GDP-L-半乳糖中，和lmMD-甘露糖-l-磷酸进行的。直接使用来自Glycoteam产品的GDP-L陽半乳糖(在该情况下，由于L-半乳糖-l-磷酸的污染而观察到高背景)，或者使用利用差向异构酶产生的GDP-L-半乳糖。在后一种情况下，0.21mg差向异构酶与GDP-D-甘露糖在20mMTrisClpH8，总体积是400uL(见Wolucka等人，2001)条件下于2(TC孵育30分钟，然后在分析中以1至20稀释直接使用。加热至100'C持续3分钟10分钟后终止该分析，或直接与磷酸酶和L-半乳糖脱氢酶结合以测定分析期间产物的形成。将加热终止的检测物在冰上冷却，离心去除沉淀的蛋白质和使用上述的结合酶检测的L-半乳糖(也可见(Laing等人,2004))。L-半乳糖的分析与加入的L-半乳糖-l-磷酸在检测范围内是线性的。使用空载体对照进行背景分析，其产生与煮沸的酶的对照相同的结果。作为另外的检测，用LCMS鉴定上述正向反应，以及检测反向的焦磷酸化酶反应，其中GTP(1mM)和L-半乳糖-l-磷酸按照上述方法孵育，且形成随后的GDP-L-半乳糖。在MS之前，通过HPLC分离GDP-D-甘露糖和GDP-L-半乳糖。LC-MS使用结合至EttanTMMDLC(GEHealthcareBio-Sciences)上的适合ESI界面的LTQ线性离子阱质谱仪(lineariontrapmassspectrometer)(ThermoQuest,Fi皿igan，SanJose,CA,USA)。使用维持在40°C的100x2.1mm的Hypercarb柱(ThermoElectron,USA)达到GDP-D-甘露糖和GDP-L-半乳糖的分离。溶剂是(A)50mM乙酸铵和(B)乙腈，流速是200uL/min。最初的流动相，5。/。B持续3分钟，然后于11分钟时线性倾斜至20%B，持续5分钟，然后于19分钟时倾斜至70%B，并持续5分钟，然后恢复至最初的条件。GDP-D-甘露糖和GDP-L-半乳糖的截留时间分别是16.8分钟和17.5分钟。在负性模式下，使用选择性的反应监测(SRM)方法SRMm/z604〉m/z344，362,424,442和选定的离子监测(SIM)方法SIMm/z604获得MS数据。该SIM方法仅检测GDP-D-甘露糖和GDP-L-半乳糖的(M-H)-离子，同时SRM方法监测通过将这两种化合物的前体离子(M-H)-片段化而形成的特别的子系离子。这两种方法通过从其他存在的化合物中过滤掉任何化学噪音把敏感度增加到最大限度。将ESI电压、毛细管温度、外壳气体压力(sheathgaspressure),扫描气体和辅助气体分别设置在-10V、350°C、25psi、3psi和3psi。使用100x2.1mm维持在40°C的Hypercarb柱(ThermoElectron,USA),平等地达到D-甘露糖-l-磷酸和L-半乳糖-l-磷酸的分离。溶剂是(A)20mM乙酸铵和(B)甲醇，且流速是200uL/min。使用2。/。B的流动相，D-甘露糖-l-磷酸和L-半乳糖-l-磷酸的截留时间分别是4.3min和4.9min。在负性模式下，使用选择性反应检测(SRM)方法SRMm/z259〉m/z79,97和选定的离子监测(SIM)方法SIMm/z259获得MS数据。烟草叶中转移酶的活性通过下列步骤来测定:在约5倍的体积的TrisClpH8.0,2mMDTT和1mMEDTA中提取液氮研碎的叶子，离心，使用以同样缓冲液平衡的NAP脱盐柱使上清脱盐，并使用上述的结合检测分析该酶。提取物中的蛋白质使用BioradBradfordCoumassie分析(Bradford,1976)测定，BSA用作标准。兹菜申请人将这些基因在pET30载体上在大肠杆菌中表达，并使用His标签和Ni螯合柱纯化蛋白质。该蛋白质在SDS凝胶上为55KD，且构成约90%的分离蛋白质。含有空pET30载体的对照也以同样的方式处理。申请人使用两种检测来鉴定该酶，使用两种来源的底物GDP-L-半乳糖。第一种检测使用大肠杆菌表达的结合酶L-半乳糖-l-磷酸磷酸酶和L-半乳糖脱氢酶。该磷酸酶对于L-半乳糖-l-磷酸是高度特异性的，否则仅显著地将肌醇-l-P脱磷酸(Laing等人，2004)。该脱氢酶对于L-半乳糖是特异性的，不与D-甘露糖或D-半乳糖或一系列其它糖发生反应(Gatzek等人2002;Laing等人，2004)，除了L-Gulose(古洛糖)。就这后一种底物而言，L-半乳糖脱氢酶表现出约2.5倍高的最大速率和30倍的Km(底物)，导致在有限的底物浓度下，L-古洛糖与L-半乳糖相比约8%的活性。结果是，我们的结合检测基本上测定L-半乳糖，且也测定L-古洛糖。申请人检测通过在检测中加入结合酶形成的产物，或者检测NADH形成的时程，或者通过10分钟后煮沸3分钟和离心终止该反应。在这后一种时间固定的检测中，申请人然后加入结合酶检测L-半乳糖的产生或者使用LCMS检测产物。使用LCMS仅用于确认结合酶反应的结果并检测反向反应。使用LCMS和结合反应检测产物，清楚的是大肠杆菌表达的猴桃EST319998和At4g26能催化GDP-L-半乳糖转变为L-半乳糖-l-P。取决于酶的浓度，时程是线性的，持续近10分钟，且反应速率与加入的酶在检测范围内是线性的(数据未显示)。在煮沸的酶或空载体存在条件下，没有反应出现(图2)。D-甘露糖-l-P对于脒基部分比对于磷酸或焦磷酸是更好的受体，但是在这些底物是生理浓度时，发现与这后两种化合物的反应(图3)。在有GDP-D-甘露糖，无差向异构酶时，或者有两种底物中一种底物，且无结合酶时，未发现NAD还原活性(数据未显示)。使用从商家购买的GDP-L-半乳糖-l-磷酸进行的反应具有很高的背景，这是因为L-半乳糖-l-磷酸的污染，且是在固定的时程内进行检测。这一底物显示出比用差向异构酶产生的底物进行反应时的速率稍高。测定了其它脒基受体，且发现该酶接受广范的己糖-l-P底物，尽管D-葡萄糖-6-P仅以最佳受体速率的约25%进行反应(表2)。反应不需要Mg(数据未显示)，尽管由于磷酸酶需要Mg而在结合检测中包括Mg。使用表达拟南芥属"ra6Wo^^J序列(At4g26850)的结合检测也显示出与猕猴桃EST319998具有相似的特性的转移酶活性(数据未显示)。表2.不同糖的磷酸作为脒基受体对于转移酶活性的影响。使用差向异构酶产生的底物进行酶的检测，且在其它条件下连续进行结合检测如在方法中描述。N=6.(时程319998111006.xls)。底物速率nmol/sec/ug蛋白质标准误差%D-甘露糖-lPD-葡萄糖-l-P0.350.036106D-葡萄糖-6-P0.080.00224D-葡萄糖-l-P0.240.0574L-肌醇-l-P0.420.07126D-半乳糖-l-PD-甘露糖-l-P0.380.011130.330.07100使用LC质谱确认反应产物是L-半乳糖-l-磷酸(表3)。这包括使用液相层析法分离反应产物，该方法从D-甘露糖中分离L-半乳糖，并从GDP-D-甘露糖中分离GDP-L-半乳糖，且产物的同一性通过其分子量确认。检测到的逆反应是极少至无。表3.通过LCMS检测转移酶活性。使用固定时间检测，于高或低蛋白质浓度和不同受体和底物的组合进行活性的检测(如表所示)。检测通过煮沸终止，且等份使用结合酶或者通过LCMS测定。未检测nm。底物受体ug蛋白nmol/sec/ug蛋白质质结合检测LCMSGDPMan/epim甘露糖-l-P0.0570.0120.0094GDPMan/epim无1.140扁380扁31GDPMan/epim无0.0570扁120GDPGal甘露糖-l-P0.0570.017高BGGDPMan/epimPPi1.140細950細3GDPMan/印imPPi0.0570.00260.0031GDPManGallP1.14nm0GDPManGallP0.057nm0GTPGallP1.14nm0GTPGallP0.057nm057苷酸，增加植物中产生的GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性和抗坏血酸膨靴僻含有克隆在pGreen(Hellens等人2000)上的猕猴桃GDP-L-半乳糖脒基转移酶(EST319998)基因的土壤杆菌与含有以前描述的(Hellens等人,2005)沉默抑制子P19基因的土壤杆菌"grak"m'謂)混合，瞬时转化烟草本塞姆氏(iV/cW/a"a6e"Aa冊'a"a)。使用在pGreen上仅含有的P19的土壤杆菌(^gra^c^7'MW)进行对照。转化后9天收获烟叶，并将其冻在液氮中。在无还原剂条件下在偏磷酸中如前所述提取抗坏血酸(Davey等人，2003;RassamandLaing,2005)。当以与作为沉默的抑制子P19混合的含有位于载体pGreen上的猕猴桃EST319998的土壤杆菌Ugra6a"ehww)克隆瞬时转化烟叶时，能检测叶子提取物中的可检测活性(图4A)。发现在仅单独转化P19的烟叶中有极低的活性(是转化的~2%)(图4)。对照组中低的酶水平是在抗坏血酸生物合成的L-半乳糖途径中典型的其它酶的水平(WLaing，未发表的观察结果)。注射土壤杆菌(^ro6""m'讓)的不同年龄的一系列叶子中出现该活性。与对照叶子相比，同样转化319998的叶子显示出抗坏血酸有非常显著的3倍增加(图4)。实施例5:猕猴桃的抗坏血酸途径基因的基因表达分析显示，GDP-L-半乳糖脒基转移酶的高表达与抗坏血酸产生的增加相关。使用qPCR检测猕猴桃的两个物种的发育中果实的抗坏血酸生物合成的L-半乳糖途径中的关键步骤基因的基因表达。美味猕猴桃含IOOmg/100gFW抗坏血酸，且毛花猕猴桃含多IO倍的抗坏血酸。显示基因表达显著增加的唯一步骤，与抗坏血酸的增加平行，该步骤是GDP-L-半乳糖-l-磷酸转移酶的基因(表ls)。这支持了在烟叶中这同一基因的过表达导致抗坏血酸水平增加3倍的观察结果。表ls:与看家基因((PPPRSA;表达设置到l)相比，开花后4周的Hayward和毛花猕猴桃果实中的L-半乳糖抗坏血酸的生物合成途径成员表达的相对水平。毛花猕猴美味猕猴桃桃变化倍数酶底物(Hajwflr力(XZ-^^flJGDP-甘露糖-3'，5'-差向异构GDP-甘露糖1.82.41.3酶GDP-L-半乳糖脒基转移酶L-半乳糖-卜磷GDP-L-半乳糖L-半乳糖-l-磷酸L-半乳糖L-半乳糖酸-l,4-内L-半乳糖脱氢酶L-半乳糖酸-l,4-内酯脱氢酶L-抗坏血酸开花后4周果实中的L-抗坏血酸(mg/100mg鲜重)脂4.10.7未检测10031.2*1.8*1.2*未检测10857.62.60.810.9*显著地区别于Hayward(p^.05)实施例6:GDP-L-半乳糖脒基转移酶的猕猴桃EST的变体公开的GDP-L-半乳糖脒基转移酶的猕猴桃EST的几种变体序列经鉴定基本上如实施例2中所述，其来自Genbank或来自拥有所有权的HortResearchdeEST数据库猕猴桃和苹果序列。所有11条蛋白质序列通过ClustalX(Jeanmougin等人,1998,r固A5/oc/z泄Sc/.23，403-5.)进行比对，如图6所示。这些序列都显示显著同源的区域，且包括两个完全保守的基序AINVSPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)和GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)，这两条基序经比对序列的视觉检查而鉴定。当序列SEQIDNO:12或13中的任一条序列在blastp(Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.&Lipman，D.J.(1990)"Basiclocalalignmentsearchtool."J.Mol.Biol.215:403-410)中用于查找GenBank的翻译蛋白质数据库(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgidb=protein)(3rdMarch2007)时，除了夷卩些在本发明序列列表中公开的序列，没有其它含有完全保守基序的植物序列鉴定出来。因此，这两条序列基序中任一个似乎可用于判断本发明所述的GDP-L-半乳糖脒基转移酶，或者在本发明所述的方法中使用。所有多肽序列之间的同一性％显示在图7中。图8显示苹果和猕猴桃序列丛集在一起，以及水稻和番茄序列是更加分离的无根的树。序列使用Blastp査找Genbank和HortResearch数据库鉴定，并用ClustalX进行比对，用Treeview进行可视化。如图9所示，每条多核苷酸序列编码区的DNA序列也用ClustalX进行比对。所有多核苷酸编码序列之间的％序列同一性如图10所示。实施例7:从猕猴桃和苹果中鉴定GDP-D-甘露糖差向异构酶序列申请人在纽西兰园艺和食品研究所拥有所有权的猕猴桃和苹果EST数据库中进行Blast查找，以鉴定与At5g28840同源的EST。申请人选定三个序列作为潜在的GDP-D-甘露糖差向异构酶的编码序列，两个来自猕猴桃(169164—KUFA:SEQIDNO:38和1998296—KALA:SEQIDNO:39),且一个来自苹果(108403—AAOA:SEQIDNO:40)。相应的多肽序列分别显示于SEQIDNO:25、26和27。申请人从公共数据库中还鉴定出其它的GDP-D-甘露糖差向异构酶序列，其具有SEQIDNO:42至48的多核苷酸序列，编码多肽序列SEQIDNO:29至35。多肽序列使用ClustalX(ClustalX(Jeanmougin等人，1998))比对，如图11所示。序列之间的%序列同一性水平见图12。申请人还鉴定出两条序列基序(SEQIDNO:36和37)，其在所有经比对的序列中完全保守。实施例8:猕猴桃的GDP-D-甘露糖差向异构酶序列在大肠杆菌中的表达和酶活性的鉴定使用标准技术将美味猕猴桃的198296—KALA序列(SEQIDNO:39)克隆进pET30A(Novagene,USA)，并使其在大肠杆菌中表达。用N末端Hiss标签纯化蛋白质。平行表达和纯化空载体对照。这些技术基本上如前所述(Laing等人,2004)。His-蛋白质在5mLHiTrapQFF柱(GEHealthcare)上脱盐。方法如实施例3中所述。酶活性检测如文献所述(Wolucka等人,2001)。0.21mg差向异构酶与GDP-D-甘露糖于20。C—同在总体积是400uL的20mMTrisCl，pH8(见Wolucka等人，2001)中孵育30分钟。通过HPLC分离反应产物以鉴定该反应产物新合成的GDP-L-半乳糖。通常使用反相柱。碧菜该蛋白质在SDS凝胶上出现在50KD位置并组成分离出来的蛋白质的约90%。含有空pET30载体的对照也以同样方法进行处理。实施例9:通过表达本发明所述差向异构酶的多核苷酸，增加植物中产生的GDP-D-甘露糖差向异构酶活性和抗坏血酸淑印層好靴含有克隆在pGreen(Hellens等人，2000)上的GDP-D-甘露糖差向异构酶(169164—KUFA:SEQIDNO:38)和/或GDP-L-半乳糖脒基转移酶(EST319998—AcSEQIDNO:14)猕猴桃基因的分离的土壤杆菌培养物与含有以前描述的(Hellens等人,2005)沉默抑制子P19基因的土壤杆菌混合，瞬时转化烟草。使用在pGreen上仅含P19的土壤杆菌进行对照。转化后9天收获烟叶，并将其冻在液氮中。在无还原剂条件下，在偏磷酸中如前所述提取抗坏血酸(Davey等人，2003;Rassam禾口Laing，2005)。当以混合了作为沉默抑制子P19的含有载体pGreen上的猕猴桃EST319998的土壤杆菌(^gra^"eWww)克隆瞬时转化烟叶时，能检测叶子提取物中的可检测活性。在仅转化P19的烟叶中发现极低的活性(是转化的2%)。以含有携带差向异构酶或P19的pGreen载体的土壤杆菌浸润叶子，或者以仅含有aceto-syringinone的水注射叶子，对叶子的抗坏血酸水平没有影响。以携带转移酶基因的土壤杆菌浸润烟叶，导致烟叶中抗坏血酸水平升高3倍，如前所示(Laing等人,2007)。然而，以差向异构酶和转移酶的混合物注射叶子可使抗坏血酸水平另外升高2倍(表2)，共达到6倍，如下表2所示。表2.分别或一同瞬时表达GDP-L-半乳糖脒基转移酶(319998)或GDP-D-甘露糖差向异构酶(169164)的基因后，叶子的抗坏血酸水平。在每一种情况下，病毒抑制子蛋白基因P19也与另两种基因一同表达。对照或者单独用P19，或者单独用乙酰丁香酮(aceto-syringone)土壤杆菌感染试剂(同样的结果)。数据代表三个植物的均值，每株植物取三个叶子(9次检测，除了对照，其中数据代表18次检测)。平均数SE抗坏血酸的相对量34.22.71.0处理对照差向异构酶转移酶差向异构酶+转33.32.31.0102.07.43.0194.222.65.7这些实验表明本发明所述差向异构酶序列的过表达能增加植物中抗坏血酸的产生。这一点通过下列结果证实由于GDP-L-半乳糖脒基转移酶的过表达，植物中抗坏血酸己经增加3倍的抗坏血酸水平再增加2倍。实施例10:通过改变植物中表达的本发明所述转移酶和差向异构酶序列的比例操作抗坏血酸的产生雄享衔好过教通过注射悬浮的含有目的基因的土壤杆菌培养物，使用瞬时表达系统((Hellens等人，2005))转化烟草。GDP-甘露糖差向异构酶是来自毛花猕猴桃的EST169164，转移酶是来自中华猕猴桃的EST319998。然后收获叶子，并检测抗坏血酸水平。此外，在一些情况下，还检测酶的活性。所用的方法如实施例9中所述。研究本发明所述的差向异构酶和转移酶序列之间的相互作用和协同作用是通过滴定这两个基因，所述基因作为混合物注射进入烟草中。在所有的一种与另一种酶的组合中，含有土壤杆菌"grak/"m'ww)悬浮物的转移酶(EST319998)和差向异构酶(169164)的体积不等，其从0加0.01、O.l和lmL。在所有情况中还加入P19以避免基因沉默。结果(图15)显示，在缺乏转移酶的条件下，增加差向异构酶的水平对叶子中的抗坏血酸没有影响。然而，在转移酶存在条件下，抗坏血酸以饱和曲线响应差向异构酶的增加。在另一方面，由于在存在不同量的差向异构酶的条件下转移酶是增加的，不能达到饱和。该数据表明，这两个基因协同作用，但是，相对于差向异构酶，需要更大体积的转移酶来使叶子的抗坏血酸达到最大浓度。在该实验中，申请人观察到在所用的两种酶达到最大量时叶子的抗坏血酸增加7.5倍。将一个简单的双曲线模型拟合到这些数据上，预测在转移酶和差向异构酶达到饱和时叶子的抗坏血酸增加9倍。实施例11:联合表达本发明所述的差向异构酶序列和本发明所述的各种转移酶序列使植物中的抗坏血酸的产生增加检测在猕猴桃差向异构酶(169164)存在条件下，以猕猴桃(319998一Ac)、番茄(BT013858_Lc)和苹果(82552—Md)的GDP-L-半乳糖转移酶基因瞬时转化(通过实施例8所述的方法)的烟叶中的抗坏血酸的产生。猕猴桃319998的转化也在三种不同的载体构建体/土壤杆菌菌株结合体(combination)中进行。结果如图16所示。对于所有显示的物种，转移酶增加叶子中的抗坏血酸水平，且加入差向异构酶以协同方式进一步增加抗坏血酸。EST319998通常是达到上述作用的最有效的基因。所有三种不同的载体和土壤杆菌克隆相似地起作用。申请人:还检测了319998的两种专门的构建体。第一种是克隆进入提供双丙氨膦(bialaphos)抗性的pGreenII022962-SK中的319998转移酶(HellensRP，EdwardsEA,LeylandNR,BeanS,MullineauxPM(2000)pGreen:aversatileandflexiblebinaryTivectorforAgrobacterium-mediatedplanttransformation.PlantMol.Biol.42:819-32)。这个构建体能用于在同一植物中产生转移酶和差向异构酶双转化的植物，但是具有两种不同的选择标记，其用于选择这两种基因。图17的结果显示，该构建体是完全功能性的。该实验还比较了猕猴桃(169164)和苹果(108403)的差向异构酶，表明这两种酶可有效地与转移酶协同地增加抗坏血酸。为了使植物来源的蛋白质纯化更容易，第二种构建体包括在pGreen的31998转移酶序列基因前部的His标签。当瞬时转化进入烟叶中时，该构建体对于增加叶子中的抗坏血酸是有活性的(图17)。实施例12:在转基因植物中表达本发明所述的转移酶序列，增加抗坏血酸的产生。申请人产生用含有pGreen中的转移酶319998(CloughSJ和BentAF，1998.62Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana)的土壤杆菌用floraldipping方法转化的拟南芥属植物(PlantJ16:735-7430)。收集种子并选择卡那霉素抗性品系。回收44个卡那霉素抗性品系，其中19个试验了卡那霉素抗性分离比率。该数据见图18。在该数据的基础上，选择下列品系进行进一步研究2、6、8、16、21、34、37、40、41、43、44，其中3种仅含有一个插入片段。在第二代，每种品系有多达12株植物从卡那霉素平板上挑选出来，使其在温室中生长至标准大小的完整叶瓣，并进行抗坏血酸检测(图19)。在卡那霉素抗性基础上挑选的11个品系中的9个表现出显著的抗坏血酸增加。增加的抗坏血酸达到超过4倍于拟南芥叶子中正常的抗坏血酸水平。一些植物相对于对照植物(例如品系8和16)显示出减少的抗坏血酸，这提示出现基因沉默。在该品系内，这些品系具有高和低的抗坏血酸植物的混合物。将从第二代中选择的植物进行下一代培养。在存在选择标记的条件下，通过将其培养在卡那霉素平板上对这些植物进行检査，其显示是卡那霉素抗性的。申请人还观察到了其叶子中抗坏血酸是对照水平的4倍以上的植物(图20)，但是还观察到在有高抗坏血酸子代的品系之中，总有一些植物具有高和低的抗坏血酸，尽管所有植物来源于高抗坏血酸的卡那霉素抗性亲本。再之，这提示基因沉默的出现。当抗坏血酸水平下降到未转化植物叶子的抗坏血酸以下的时候，这尤其是这种情况，也提示了内源性基因也被沉默了。当319998与拟南芥64ra6Wo;^;^序列进行比对时，发现完全序列同一性的区域(数据未显示)。这可能是见到的明显基因沉默的原因。申请人检查了第三代植物的319998基因表达(图21)。在每一种情况下，相对对照具有高抗坏血酸的植物也显示出319998表达增强。在一种情况下，具有低抗坏血酸的植物(在这个品系中没有植物具有高抗坏血酸)也显示出319998高表达。这可解释为意味着在这个品系的基因沉默期间，出现一些基因的表达，如经我们的qPCR方法检测的那样。实施例13:转基因烟草中本发明所述的转移酶基因的表达导致抗坏血酸含量增加以319998转化烟草，并选择卡那霉素抗性品系。这些植物被转移到土壤中生长直至长出几片叶子。检测这些叶子中的抗坏血酸和基因表达(图22)许多品系显示基因表达，且两个品系还显示出叶子中抗坏血酸显著增加60%。烟草(Nicotianatabacum)"Samsun"用携带含有EST319998的pHex载体的根癌土壤杆菌"gra6a"e〃'wmftwje/ade朋)株GV101转化。所用的方法如Guerineau等人(1990)所述，除了用卡那霉素取代比率为100mg丄-l的磺酰胺选择性试剂。实施例14:本发明所述的转移酶和差向异构酶序列在大肠杆菌中的表达和酶活性的验证。各种转移酶基因被克隆进入pET30载体中，并转化大肠杆菌。带有His-Trap标签的蛋白质被表达、提取，通过金属离子层析法纯化，用G25柱脱盐。用结合检测进行活性检测，其中使用GDP-D-甘露糖/GDP-L-半乳糖混合物(通过将EST198296表达的GDP-甘露糖差向异构酶蛋白质与GDP-甘露糖混合产生)作为底物进行检测。该底物混合物与要检测的转移酶孵育，伴有过量的结合酶(更多的差向异构酶，L-半乳糖磷酸酶，L-半乳糖脱氢酶)和50mM双丙烯酰胺三羟甲基氨基甲烷丙垸(Bistrispropane)pH7.5,0.5mMNAD和2.5mMMgCl2。检测随时间和加入转移酶的量呈线性。检测活性是在0.1至0.7nmol/mg蛋白质/sec范围内(图23)。检测的所有表达的基因显示转移酶活性。此外，表达EST198296和108403的大肠杆菌也显示差向异构酶活性(数据未显示)，如通过HPLC和直接结合检测所检测到的。不能将本发明的范围限于上述实施例。如本领域技术人员所理解，许多变化是可能的，其没有脱离本发明的范围。参考文献AgiusF,Gonzalez-LamotheR，CaballeroJL,Munoz-BlancoJ，BotellaMA,ValpuestaV(2003)EngineeringincreasedvitaminClevelsinplantsbyoverexpressionofaD-galacturonicacidreductase.NatBiotechnol21:177-181.AltschulSF,MaddenTL,SchafferAA,ZhangJ,ZhangZ，MillerW,LipmanDJ(1997)GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsRes25:3389-3402.BaileyTL，ElkanC(1994)Fittingamixturemodelbyexpectationmaximizationtodiscovermotifsinbiopolymers.InProceedingsoftheSecondInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology.AAAIPress,MenloPark,California,pp28-36.BartoliCGGuiametJJ,KiddleG,PastoriGM,DiCagnoR，TheodoulouFL，FoyerCH(2005)Ascorbatecontentofwheatleavesisnotdeterminedbymaximall-galactono-l,4-lactonedehydrogenase(GalLDH)activityunderdroughtstress.Plant,CellandEnvironment28:1073-1081.BradfordM(1976)Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipalofprotein-dyebinding.AnalyticalBiochemistry72:248-254.BrennerC(2002)Hint,Fhit,andGalT:Function,Structure,Evolution,andMechanismofThreeBranchesoftheHistidineTriadSuperfamilyofNucleotideHydrolasesandTransferases.Biochemistry41:9003-9014.BrennerC，GarrisonP,GilmourJ,PeisachD，RingeD，PetskoGA,LowensteinJM(1997)CrystalstructuresofHINTdemonstratethathistidinetriadproteinsareGalT-relatednucleotide-bindingproteins.NatStructBiol4:231-238.ChenZ,YoungTE，LingJ,ChangSC,GallieDR(2003)IncreasingvitaminCcontentofplantsthroughenhancedascorbaterecycling.ProcNatlAcadSci100:3525-3530.ConklinPL(1998)VitaminC:anewpathwayforanoldantioxidant.TrendsPlantSci3:329-330.ConklinPL,GatzekS,WheelerGL，DowdleJ，RaymondMJ,RolinskiS,IsupovM,LittlechildJA，SmirnoffN(2006)ArabidopsisthalianaVTC4EncodesL-Galactose-l-PPhosphatase,aPlantAscorbicAcidBiosyntheticEnzyme.J.Biol.Chem.281:15662-15670.ConklinPL,NorrisSR，WheelerGL，WilliamsEH,SmirnoffN,LastRL(1999)GeneticevidencefortheroleofGDP-mannoseinplantascorbicacid(vitaminbiosynthesis.ProcNatlAcadSciUSA96:4198-4203.ConklinPL，SaraccoSA，NorrisSR,LastRL(2000)IdentificationofAscorbicAcid-DeficientArabidopsisthalianaMutants.Genetics154:847-856.DaveyMW,DekempeneerE,KeulemansJ(2003)Rocket-poweredhigh-performanceliquidchromatographicanalysisofplantascorbateandglutathione.AnalyticalBiochemistry316:74-81.FergusonAR,MacRaeEA(1992)VitaminCinActinidia..ActaHorticulture297:48"87.GatzekS,WheelerGL，SmirnoffN(2002)Antisensesuppressionof1-galactosedehydrogenaseinArabidopsisthalianaprovidesevidenceforitsroleinascorbatesynthesisandrevealslightmodulated1-galactosesynthesis.PlantJournal30:541-553.GuerineauF，BrooksL,MeadowsJ,LucyA,RobinsonC,MullineauxP(1990)Sulfonamideresistancegeneforplanttransformation.PlantMolecularBiology15:127-136HellensR，AllanA,FrielE，BolithoK,GraftonK,TempletonM，KamnairetnamS,GleaveA,LaingW(2005)Transientexpressionvectorsforfunctionalgenomics,quantificationofpromoteractivityandRNAsilencinginplants.PlantMethods1:13.HellensRP,EdwardsEA,LeylandNR,BeanS,MullineauxPM(2000)pGreen:aversatileandflexiblebinaryTivectorforAgrobacterium-mediatedplanttransformation.PlantMolBiol42:819-832.HoldenHM,RaymentI,ThodenJB(2003)StructureandFunctionofEnzymesoftheLeloirPathwayforGalactoseMetabolism.J.Biol.Chem.278:43885-43888.ImaiT,KaritaS,ShiratoriQHattoriM,NunomeT,ObaK,HiraiM(1998)L-galactono-gamma-lactonedehydrogenasefromsweetpotato:PurificationandcDNAsequenceanalysis.PlantandCellPhysiology39:1350-1358.IshikawaT，DowdleJ，SmirnoffN(2006)Progressinmanipulatingascorbicacidbiosynthesisandaccumulationinplants.PhysiologiaPlantarum126:343-355.JanderQNorrisSR，RounsleySD,BushDF,LevinIM,LastRL(2002)ArabidopsisMap-BasedCloninginthePost-GenomeEra.PlantPhysiol.129:440-450.JeanmouginF,ThompsonJD,GouyM，HigginsDQGibsonTJ(1998)MultiplesequencealignmentwithClustalX.TrendsBiochemSci23:403-405.KellerR,RenzFS,KossmannJ(1999)AntisenseinhibitionoftheGDP-mannosepyrophosphorylasereducestheascorbatecontentintransgenicplantsleadingtodevelopmentalchangesduringsenescence.PlantJ19:131-141.LaingWA,BarracloughD,BulleyS，CooneyJ,WrightM，MacraeE(2004)AspecificL-Galactose-1-Phosphatephosphataseonthepathtoascorbatebiosynthesis.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences(USA)101:16976-16981.LaingWA,FrearsonN，BulleyS,MacCraeE(2004)KiwifruitL-Galactosedehydrogenase;molecular,biochemicalandphysiologicalaspectsoftheenzyme.FunctionalPlantBiology31:1015-1025.Laing,^V.A.,^Vright,M.，Cooney,J.&Bulley,S.(2007)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences(USA)104:9534-9..LorenceA，ChevoneBI,MendesP，NesslerCL(2004)myoinositolOxygenaseOffersaPossibleEntryPointintoPlantAscorbateBiosynthesis.PlantPhysiol.134:1200-1205.PiroQZuppaA，DalessandroQNorthcoteDH(1993)Glucomannansynthesisinpeaepicotyls:themannoseandglucosetransferases.Planta190:206-220.RadzioJA,LorenceA,ChevoneBI,NesslerCL(2003)L-Gulono-l,4-lactoneoxidaseexpressionrescuesvitaminC-deficientArabidopsis(vtc)mutants.PlantMolBiol53:837-844.RassamM,LaingW(2005)VariationinAscorbicAcidandOxalateLevelsintheFruitof<i〉Actinidiachinensis</i〉TissuesandGenotypes.丄Agric.FoodChem.53:2322-2326.RedgwellRJ(1983)CompositionofActinidiamucilage.Phytochemistry22:951-956.RedgwellRJ，MeltonLD,BraschDJ(1990)Cellwallchangesinkiwifruitfollowingpostharvestethylenetreatment.Phytochemistry29:399-407.SchafferAA，AravindL,MaddenTL,ShavirinS,SpougeJL，WolfYI,KooninEV,AltschulSF(2001)ImprovingtheaccuracyofPSI-BLASTproteindatabasesearcheswithcomposition-basedstatisticsandotherrefinements.NucleicAcidsRes29:2994-3005.SeifertGJ(2004)Nucleotidesugarinterconversionsandcellwallbiosynthesis:howtobringtheinsidetotheoutside.CurrentOpinioninPlantBiology7:277-284.SmirnoffN(2001)L陽ascorbicacidbiosynthesis.VitamHorm61:241-266.TokunagaT,MiyaharaK，TabataK,EsakaM(2005)Generationandpropertiesofascorbicacid-overproducingtransgenictobaccocellsexpressingsenseRNAforl-galactono-l，4-lactonedehydrogenase.Planta220:854-863.ValpuestaV,BotellaMA(2004)BiosynthesisofL-ascorbicacidinplants:newpathwaysforanoldantioxidant.TrendsinPlantScience9:573-577.WatanabeK,SuzukiK，KitamuraS(2006)CharacterizationofaGDP-d-mannose3"，5"-epimerasefromrice.Phytochemistry67:338-346.WheelerGL,JonesMA,SmirnoffN(1998)ThebiosyntheticpathwayofvitaminCinhigherplants.Nature393:365-369.WbluckaBA,DaveyMW,BoerjanW(2001)Ahigh-performanceliquidchromatographyradiomethodfordeterminationofL-ascorbicacidandguanosine5'-diphosphate-l墨galactose，keymetabolitesoftheplantvitaminCpathway.AnalBiochem294:161-168.WoluckaBA,PersiauG，VanDoorssdaereJ,DaveyMW，DemolH，VandekerckhoveJ,VanMontaguM，ZabeauM,BoerjanW(2001)PartialpurificationandidentificationofGDP-mannose3"，5"-epimeraseofArabidopsisthaliana，akeyenzymeoftheplantvitaminCpathway.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica98:14843-14848.WoluckaBA,VanMontaguM(2003)GDP-Mannose3，，5'-EpimeraseFormsGDP-L-gulose，aPutativeIntermediateforthedeNovoBiosynthesisofVitaminCinPlants.J.Biol.Chem.278:47483-47490.序列汇总转移酶=GDP-L-半乳糖脒基转移酶差向异构酶=GDP-D-甘露糖差向异构酶SEQIDNO.内容分子类型物种索弓l(Reference)1转移酶多肽中华猕猴桃"WmWaEST319998—Ac2转移酶多肽苹果fMa/wsxEST82552—Md3转移酶多肽中华猕猴桃EST244893—Ac4转移酶多肽毛花猕猴桃(勿磁aEST24547—Ae67<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>权利要求1、一种制备具有增加抗坏血酸的植物细胞或植物的方法，该方法包括以编码多肽或该多肽变体的多核苷酸转化植物细胞或植物，所述多肽具有SEQIDNO1至11中任一个的氨基酸序列，其中该变体具有GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性。2、根据权利要求1所述的方法，其中变体包含氨基酸序列A匿SPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)。3、根据权利要求1或2所述的方法，其中变体包含氨基酸序列GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)。4、根据权利要求1至3中任一项的方法，其中多肽的变体与氨基酸序列SEQIDNO:1至11中任一个的多肽具有至少60%的序列同一性。5、根据权利要求1至4中任一项的方法，其中以编码氨基酸序列SEQIDNO:1至11中任一个的多肽的多核苷酸转化植物细胞或植物。6、根据权利要求1至5中任一项的方法，其中也以编码GDP-D-甘露糖差向异构酶的多核苷酸转化植物细胞或植物。7、一种制备具有增加抗坏血酸含量的植物细胞或植物的方法，其包括以编码多肽或该多肽变体的多核苷酸转化植物细胞或植物，所述多肽具有SEQIDNO:25至35中任一个的氨基酸序列，其中该变体具有GDP-D-甘露糖差向异构酶活性。8、根据权利要求7所述的方法，其中变体包含氨基酸序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。9、根据权利要求7或8所述的方法，其中变体包含氨基酸序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。10、根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中变体与氨基酸序列是SEQIDNO:25至35中任一个的多肽具有至少70%的序列同一性。11、根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中以编码氨基酸序列SEQIDNO:25至35中任一个的多肽的多核苷酸转化植物细胞或植物。12、根据权利要求7至11中任一项所述的方法，其中也以编码GDP-L-半乳糖脒基转移酶的多核苷酸转化植物细胞或植物。13、一种制备具有增加抗坏血酸含量的植物细胞或植物的方法，其包括以下列物质转化植物细胞或植物.-a)编码GDP-D-甘露糖差向异构酶的多核苷酸；和b)编码GDP-L-半乳糖脒基转移酶的多核苷酸。14、根据权利要求13所述的方法，其中GDP-D-甘露糖差向异构酶包含氨基酸序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。15、根据权利要求13或14所述的方法，其中GDP-D-甘露糖差向异构酶包含氨基酸序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。16、根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中GDP-D-甘露糖差向异构酶包含与SEQIDNO:25至35中任一个的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的序列。17、根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中GDP-D-甘露糖差向异构酶包含SEQIDNO:25至35中任一个的氨基酸序列。18、根据权利要求13所述的方法，其中GDP-L-半乳糖脒基转移酶包含氨基酸序列AINVSPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)。19、根据权利要求13或18所述的方法，其中GDP-L-半乳糖脒基转移酶包含氨基酸序列GYNSLGAFAT腿LHFQAY(SEQIDNO:13)。20、根据权利要求13、18和19中任一项所述的方法，其中GDP-L-半乳糖脒基转移酶包含与SEQIDNO:1至11中任一个氨基酸序列的多肽具有至少60%序列同一性的序列。21、根据权利要求13和18至20中任一项所述的方法，其中GDP-L-半乳糖脒基转移酶包含SEQIDNO:1至11中任一个的氨基酸序列。22、一种分离的多核苷酸，其编码包含选自SEQIDNO:1至7中任一个的序列的多肽或其变体，其中该变体是GDP-L-半乳糖脒基转移酶。23、根据权利要求22所述的分离的多核苷酸或变体，其中该变体包含序列A譜SPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)。24、根据权利要求22或23所述的分离的多核苷酸或变体，其中该变体包含序列GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)。25、根据权利要求22至24中任一项所述的分离的多核苷酸或变体，其中该变体包含与SEQIDNO:1至7中的任一序列具有至少72%同一性的序列。26、一种分离的多核苷酸，其编码包含选自SEQIDNO:1至7中任一序列的多肽。27、一种具有GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性的分离的多肽，其包含与选自SEQIDNO:1至7中任一个的氨基酸具有至少72%序列同一性的序列。28、根据权利要求27所述的分离的多肽，其包含选自SEQIDNO:l至7中任一个的氨基酸序列。29、一种分离的多核苷酸，其编码包含选自SEQIDNO:25至27中任一个序列的多肽或其变体，其中该变体是GDP-D-甘露糖差向异构酶。30、根据权利要求29所述的分离的多核苷酸或其变体，其中该变体包含序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。31、根据权利要求29或30所述的分离的多核苷酸或其变体，其中该变体包含序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。32、根据权利要求29至31所述的分离的多核苷酸或其变体，其中该变体包含与SEQIDNO:25至27中任一序列具有至少91%同一性的序列。33、一种分离的多核苷酸，其编码包含选自SEQIDNO:25至27中任一序列的多肽。34、一种具有GDP-D-甘露糖差向异构酶活性的分离的多肽，其包含与SEQIDNO:25至27的氨基酸序列具有至少91%同一性的序列。35、根据权利要求34所述的分离的多肽，其包含选自SEQIDNO:25至27中任一个的氨基酸序列。36、一种分离的多核苷酸，其包含a)—种多核苷酸，其包含权利要求22至26、29至33和36中任一项所述的多核苷酸的长度至少为15个核苷酸的片段；b)—种多核苷酸，其包含本发明所述多核苷酸的长度至少为15个核苷酸的互补链；或者d)—种多核苷酸，其包含能与本发明所述多核苷酸杂交的长度至少为15个核苷酸的序列。37、一种遗传构建体，其包含权利要求22至26、29至33和36中任一项所述的至少一种多核苷酸。38、一种表达构建体，其包含权利要求22至26、29至33和36中任一项所述的至少一种多核苷酸。39、一种RNAi构建体，其包含权利要求22至26、29至33和36中任一项所述的至少一种多核苷酸。40、一种宿主细胞，其包含权利要求37至39中任一项所述的至少一种构建体。41、一种遗传修饰的宿主细胞，其表达权利要求22至26、29至33和36中任一项所述的至少一种多核苷酸，或权利要求27、28、34和35中任一项所述的至少一种多肽。42、根据权利要求41所述的遗传修饰的宿主细胞，其表达编码GDP-L-半乳糖脒基转移酶的多核苷酸；和编码GDP-D-甘露糖差向异构酶的多核苷酸。43、一种制备GDP-L-半乳糖脒基转移酶多肽的方法，该方法包含培养能表达GDP-L-半乳糖脒基转移酶多肽的宿主细胞，所述细胞包含权利要求38所述的表达构建体或权利要求37所述的遗传构建体。44、一种制备GDP-L-半乳糖脒基转移酶的酶产物的方法，其包括在酶的底物存在条件下培养宿主细胞，所述细胞包括权利要求38所述的表达构建体或权利要求37所述的遗传构建体，能表达GDP-L-半乳糖脒基转移酶多肽，酶的底物可以补充至宿主细胞中或天然存在于宿主细胞内。45、一种制备GDP-D-甘露糖差向异构酶多肽的方法，其包括培养宿主细胞，所述细胞包含权利要求38所述的表达构建体或权利要求37所述的遗传构建体，能表达GDP-D-甘露糖差向异构酶多肽。46、一种制备GDP-D-甘露糖差向异构酶的酶产物的方法，其包括在酶的底物存在条件下培养宿主细胞，所述细胞包括权利要求38所述的表达构建体或权利要求37所述的遗传构建体，能表达GDP-D-甘露糖差向异构酶多肽，酶的底物可以补充至宿主细胞中或天然存在于宿主细胞内。47、一种生物合成抗坏血酸的方法，其包括在抗坏血酸前体存在条件下，培养宿主细胞的步骤，所述细胞包含权利要求38所述的表达构建体或权利要求37所述的遗传构建体，能表达GDP-L-半乳糖脒基转移酶，抗坏血酸前体可补充至宿主细胞中或天然存在于宿主细胞内。48、根据权利47所述的方法，其中能表达GDP-D-甘露糖差向异构酶的宿主细胞还包含权利要求38所述的表达构建体或权利要求37所述的遗传构建体。49、一种生物合成抗坏血酸的方法，其包括以下步骤在抗坏血酸前体存在条件下，培养宿主细胞，所述细胞包含能表达GDP-D-甘露糖差向异构酶的权利要求38所述的表达构建体或权利要求37所述的遗传构建体，抗坏血酸前体可以补充至宿主细胞中或天然存在于宿主细胞内。50、根据权利要求49所述的方法，其中能表达GDP-L-半乳糖脒基转移酶的宿主细胞还包含权利要求38所述的表达构建体或权利要求37所述的遗传构建体。51、一种遗传修饰的植物细胞，其表达权利要求22至26、29至33和36中任一项所述的至少一种多核苷酸，或权利要求27、28、34和35中任一项所述的至少一种多肽。52、一种植物细胞，其包含至少一种权利要求38所述的表达构建体，或至少一种权利要求37所述的遗传构建体。53、在另一个方面，本发明提供一种包含权利要求51或52所述的植物细胞的植物。54、一种选择GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性或者抗坏血酸含量改变的植物的方法，其包括检测植物的权利要求22至26和36中任一项所述多核苷酸表达的改变，或权利要求27或28所述的多肽表达的改变。55、一种选择GDP-D-甘露糖差向异构酶活性或者抗坏血酸含量改变的植物的方法，其包含检测植物的权利要求29至33中任一项所述的多核苷酸表达的改变或权利要求34或35所述的多肽表达的改变。56、一种通过权利要求1至21中任一项所述的方法制备的植物细胞或植物。57、一种或一组通过权利要求54或55所述的方法选择的植物。58、一种制备抗坏血酸的方法，其包括从权利要求51、52、56或者57中任一项所述的植物细胞或植物中提取抗坏血酸。59、一种鉴定化合物为候选除草剂的方法，其包含a)将所述的化合物与包含选自SEQIDNO:1至11中任一个序列的多肽或其具有GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性的变体接触，且b)检测所述化合物与所述多肽之间结合的存在和/或缺失；其中结合提示所述的化合物是候选除草剂。60、一种鉴定化合物为候选除草剂的方法，其包含a)将所述化合物与包含选自SEQIDNO:1至11中任一个序列的多肽或其具有GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性的变体接触，且b)评价该化合物对多肽的GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性的影响；其中活性下降提示所述的化合物是候选除草剂。61、一种鉴定化合物为候选除草剂的方法，其包含a)将所述的化合物与包含选自SEQIDNO:25至35中任一个序列的多肽或其具有GDP-D-甘露糖差向异构酶活性的变体接触，且b)检测所述化合物与所述多肽之间结合的存在和/或缺失；其中结合提示所述的化合物是候选除草剂。62、一种鉴定化合物为候选除草剂的方法，其包含a)将所述的化合物与包含选自SEQIDNO:25至35中任一个序列的多肽或其具有GDP-D-甘露糖差向异构酶活性的变体接触，且b)评价该化合物对多肽的GDP-D-甘露糖差向异构酶活性的影响；其中活性下降提示所述的化合物是候选除草剂。63、一种抗权利要求27、28、34和35中任一项所述的多肽的抗体。64、一种制备L-半乳糖-l-磷酸的方法，其包含将GDP-L-半乳糖和GDP受体与包含本发明所述多核苷酸的表达构建体的表达产物接触获得L-半乳糖-l-磷酸，其中所述GDP受体包括己糖-l-磷酸或磷酸。65、一种制备GDP-半乳糖的方法，包括将GDP-甘露糖与包含本发明所述多核苷酸的表达构建体的表达产物接触或与本发明所述的多肽接触获得GDP-半乳糖。全文摘要本发明提供调节植物中的GDP-L-半乳糖脒基转移酶(也称作GDP-L-半乳糖磷酸化酶)活性；和/或GDP-D-甘露糖差向异构酶活性；和/或抗坏血酸含量的组合物和方法。本发明提供具有增加GDP-L-半乳糖脒基转移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向异构酶活性的植物和植物细胞。本发明提供具有增加抗坏血酸含量的植物和植物细胞，这种增加是由于GDP-L-半乳糖脒基转移酶的过表达；GDP-D-甘露糖差向异构酶的过表达；或特别是GDP-L-半乳糖脒基转移酶和GDP-D-甘露糖差向异构酶的组合过表达。文档编号A01N61/00GK101687907SQ200880011227公开日2010年3月31日申请日期2008年3月7日优先权日2007年3月8日发明者S·M·W·布利,W·A·莱恩申请人:新西兰植物和食品研究院有限公司