专利名称：：抗菌肽buforinⅡ和猪INF-α融合表达毕赤酵母菌及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，更具体涉及一种抗菌肽buforinII和猪INF-a融合表达毕赤酵母工程菌，同时还涉及抗菌肽buforinII和INF-a的制备方法，抗菌肽buforinII和猪INF-a可广泛应用于动物饲料中，进一步纯化后是一种新型抗菌药物。
背景技术：
：1996年Park首次在亚洲蟾蜍Bufobufogargarizans胃组织中发现了buforinI。Buforinl与组蛋白H2A的N末端有序列同源性，是由胃蛋白酶C的同工酶Cb和Ca裂解H2A的Tyr39-Ala4°间肽键而来。BuforinII是由buforinI在胞内蛋白酶Lys-C的作用下裂解而来，是buforinl从Thr16到Lys36共21个氨基酸残基的烈性抗菌肽，buforinII的抗菌活性较buforinI强。BuforinII是一种a螺旋两亲性抗菌肽。BuforinII的作用目标是细胞内核酸而不是细胞膜，在不损坏细胞膜的情况下迅速进入细胞，并以很强的亲和力结合于胞内大分子DNA和RNA，使细菌死亡。与其他抗菌肽相比，buforinII有较好的抑菌效果。已经被用于研究治疗感染性休克和腹膜炎，并取得了很好的效果。另外buforinll的抗菌作用在与传统抗生素配伍的情况下得到增强，也使得buforinII在饲料添加剂，医药等领域有了更广的应用空间。然而天然提取抗菌肽buforinII费用极高并且产量低，化学合成费用也价格不菲，利用生物技术进行发酵生产buforinII是一个经济廉价的制备途径。目前已实现buforinII在大肠杆菌中表达。利用大肠杆菌表达buforinII虽然具有周期短，培养耗费低等有优点，但也存在后续纯化比较麻烦，不能直接应用等缺点。毕赤酵母是现在最常用的表达系统之一，具有醇氧化酶A0X1基因启动子(目前最强，调控机理最严格的启动子之一)。它的表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合，菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。另外毕赤酵母自身外分泌蛋白很少，若外分泌表达外源蛋白很容易纯化。BuforinII对真菌有一定的毒害作用，为了减免抗菌肽对毕赤酵母的毒害作用，本研究考虑把buforinll与猪干扰素a(INF-a)融合表达，连接序列是肠激酶酶切序列。表达的融合蛋白既可直接添加到饲料，猪消化后在其肠道被肠激酶酶切为有活性的抗菌肽buforinll和猪INF-a，发挥它们的生物效用。也可用肠激酶体外酶切融合蛋白，得到药用级的抗菌肽buforinII和猪INF-a，用来制作针剂。选择猪INF-a作为融合表达的蛋白理由INF-a是天然免疫和获得免疫的桥梁，可以激活NK细胞的细胞毒性并促进其增殖，调节机体免疫。而INF-a作为第一类干扰素，更是直接参与但机体对抗病毒的入侵反应，对猪流行性腹泻、轮状病毒腹泻、传染性胃肠炎等多种病毒性疾病有较好的防治作用。可作为广谱抗病毒药用于猪病毒性疾病的防治，具有抗病毒作用广泛、残留小、廉价、无污染、无耐药性、无药物残留等特点。
发明内容本发明目的在于提供了一种抗菌肽buforinll和猪INF-a融合表达的毕赤酵母工程菌，该工程菌易高密度发酵，生产的新型抗菌肽buforinII和猪INF-a融合多肽不仅表达量高，而且易于纯化，在机体肠道肠激酶的作用下可以产生高效、广谱的抗菌、抗病毒和调节免疫等生物学活性。本发明的另一个目的在于提供了一种抗菌肽buforinII和猪INF-a融合表达毕赤酵母菌的制备方法，该方法操作简便、成本低廉，该融合多肽被酶解后具有高效广谱抗菌和抗病毒活性。本发明的再一个目的是在于提供了一种融合蛋白buforinII和INF-a的制备方法。酵母pichiapasteris早已收入中国药典，是国内外公认的可供药用和食用的酵母菌种。毕赤酵母的AOX强启动子是目前最强，调控机理最严格的启动子之一，诱导物甲醇廉价，外源基因整入到菌体基因组，比较稳定，不易发生遗传丢失。发明应用改造后的毕赤酵母作为培养菌可以连续高密度发酵培养，有利于工业生产。同时所用发酵培养基廉价，培养条件容易控制，外分泌设计更大程度的减化的纯化步骤，因为毕赤酵母自身外分泌蛋白很少，目的蛋白可占总分泌蛋白总量的80-90%，最后的培养物经简单离心即可得到含有大量融合蛋白的培养液上清，再经层析就可得到较纯融合蛋白。总之，本制备方法具有经济廉价、操作简单和制备量大等优点。本发明的还有一个目的是在于提供了一种融合蛋白buforinII和INF-a在猪饲料中的应用。融合蛋白buforinII和INF-a所用培养材料，装置易得，产量大，生产成本低，抑菌和免疫系统调节效能明显，并且无药物残留，在猪饲料中有很大的应用潜力。同时由于融合蛋白可经摄食摄入，在猪饲料应用操作步骤简单。另外融合蛋白buforinII和INF-a可在猪肠道内被肠激酶分解成INF-a和buforinll，这样既可抑制肠道有害微生物的生长，还可通过调节猪机体的免疫系统，增强猪对病毒的抵抗能力。为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施表达工程菌PichiapastorisFZM2009的构建所需材料为毕赤酵母PichiapastorisKM71H及质粒pPICZAa，购自invitrogen公司；大肠杆菌GB2005和YZ2005由GeneBridge公司提供；蛋白纯化试剂购自MERK，其他常规试剂购自上海生工。大肠杆菌GB2005，YZ2005培养基为LB培养基，其组成成分为5g酵母提取物；10g蛋白胨；5g氯化钠(NaCl);加水900ml，用1M氢氧化钠(NaOH)将pH值调为7.O，定容至1L。LB固体培养基在LB液体培养基中加入琼脂粉使其终浓度为1.5%(m/v)。采用同源重组方法将表达盒P鹿「aFactor-IFNa-6XHis-bufforinII-Zeocinr与PichiapastorisKM71H基因组上的基因aoxl发生同源重组，获得一种融合表达抗菌肽buforinII与猪INF-a的毕赤酵母工程菌，命名为PichiapastorisFZM2。。9，该菌株已保藏，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏日期2009年11月11日，保藏编号CCTCCNO:M209259，分类命名毕赤酵母菌PichiapastorisFZM2009。—种融合表达抗菌肽buforinII与猪INF-a的毕赤酵母工程菌的制备方法，其步骤是A、表达盒PA。x「aFactor-IFNa-6XHis-bufforinII_Zeocinr的构建。其详细过程为首先以毕赤酵母偏好密码子人工设计合成IFNa核苷酸序列，通过两次PCR扩增得到带同源臂PCR产物IFNa-6XHis-bufforinII;然后采用Red/ET同源重组技术将IFNa-6XHis_bufforinII克隆在pPICZAa载体或质粒上，最后应用SacI酶切后得到表达盒PA。x「aFactor-IFNa-6XHis-bufforinII-Zeocinr(具体见附图1)。B、表达工程菌PichiapastorisFZM咖的构建。获得基因组整合有表达盒PA0X1-IFNa-6His-bufforinII-Zeocinr的详细过程为采用电穿孔法(1500V/cm)将线性化后表达盒PA。X1_aFactor-IFNa-6XHis-bufforinII-Zeocinr的表达质粒导入PichiapastorisKM71H中。经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定得到基因组上整合有表达盒PA0X1—IFNa—6His—bufforinIl-Zeocin的工程菌PichiapastorisFZM2。。9(具体见附图1)。该菌株已保藏，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏日期2009年11月11日，保藏编号CCTCCNO:M209259，分类命名毕赤酵母菌PichiapastorisFZM誦。—种融合蛋白buforinII和INF-a的制备方法，其步骤是A、材料与溶液配制本发明所提供PichiapastorisFZM2。。9。工程菌培养基为实验发酵优化培养基，各成分质量分数％:葡萄糖4%、氨水150iiL、磷酸二氢钾(KH2P04)0.7%，七水硫酸镁(MgS04.7H20)0.03%，七水硫酸铁(FeS04.7H20)0.05%，一水硫酸镁(MnS04.H20)0.05%，蛋白胨0.1%，pH5.5;PTM1配方为硫酸铜(CuS04)6g/L，碘酸钾(KI)O.08g/L，一水硫酸镁(MnS04H20)3g/L，二水合钼酸钠0.2g/L，硼酸(H3B03)0.02g/L，氯化锌(ZnCl2)20g/L，氯化钴0.5g/L，七水硫酸铁(FeS04.7H20)65g/L，生物素(Biotin)O.2g/L，硫酸(H2S04)5mL/L。B、融合蛋白IFNa-buforinII的制备步骤是1)在含有100iig/mlzeocin的YPD平板上复苏PichiapastorisFZM2009;2)从平板上挑单克隆于含有YPD培养基中，3(TC振摇(240rpm)培养17h;3)将一体积培养17h的PichiapastorisFZM2。。9，接种于十倍体积优化发酵培养基中，30°C，260rpm，振摇培养4d;期间每8h补加0.15%氨水(v/v分析纯氨水)，24h补加1%甲醇(v/v分析纯)，0.4%PTM1(v/v);4)8000rpm(4。C)离心3min，获取上清；5)取10ill上清，进行SDS-PAGE电泳检测；6)上清液过分子筛凝胶柱，收集相应组分；7)冷冻干燥收集的相应组分，得到融合蛋白buforinII和INF-a;8)用肠激酶酶切获得buforinII禾PIFNa。—种融合蛋白buforinII和INF-a在仔猪饲料中应用过程是将冷冻干燥融合蛋白buforinII和INF-a，直接与添加剂混合，再进一步配成全价饲料，应用于仔猪饲料中，融合蛋白buforinII和INF-a最终添加量为每kg日粮中含80mg_100mg融合蛋白buforinII禾口INF-a。本基因工程技术生产融合蛋白buforinII和INF-a解决了buforinII对宿主菌自杀作用强这一难点，所生产的新型融合多肽不仅表达量高，酶解或机体肠道消化后还具有高效、广谱抗菌、抗病毒、和调节免疫等生物学活性，而且同现有其它基因工程技术生产融合蛋白buforinII和INF-a相比具备以下特点1、使用本表达系统生产新型抗菌肽buforinII可克服buforinII对宿主菌的毒害作用，其原因是本表达系统应用猪干扰素a作为融合蛋白，消除了buforinII对宿主菌的自杀作用；2、利用Red/ET同源重组技术将质粒整合入工程菌基因组，遗传更稳定。3、表达量比较高，并且容易纯化，因为毕赤酵母自身外分泌蛋白少，表达的蛋白60%是目的蛋白。4、发酵使用的培养基廉价，纯化工艺简单，使得蛋白生产成本大幅度降低。图1为抗菌肽buforinII和猪INF-a融合表达毕赤酵母工程菌构建全过程示意图其中P1:~^;P2~~I;P3~具体实施方式实施例1:抗菌肽buforinII和猪INF-a融合表达的毕赤酵母工程菌的构建及抗菌肽buforinII的制备方法。1材料1.1菌种和载体菌种及载体基因型和来源见表1。表1菌种及载体基因型和来源菌种或载体基因型来源￡.co//GB2005突变型德国genebrigdes公司(www.genebrigdes.com)Eco//YZ2005突变型德国genebrigdes公司(www.genebrigdes.com)InvitrogenKM71HFZM磨aoxl::H-PAoxi-aFactor-IFNa-6><His-bufforinII-Zeocinf由本发明获得pPICZAaZcocinfInvi加genpPICZAa-IFNa-6His-带有猪IFNa和抗菌肽bufforinII基由本发明获得bufforinII因序列的载体；Zeocin11.2工具酶RNaseA、ProteinaseK购自上海生工公司；限制性内切酶购自promega;2*PCRmasterMix购自北京天根生物技术公司。1.3试剂盒小量、中量及大量提取质粒试剂盒，酵母基因组试剂盒为QIAGEN公司产品。1.4培养基LB液体培养基酵母提取物5g;蛋白胨10g;NaCl5g;加水定容至1L。LB固体培养基在LB液体培养基中加入终浓度为1.5%(m/v)的琼脂粉。下面根据图1对本发明作进一步详细描述—种融合表达抗菌肽buforinII和猪INF-a的毕赤酵母工程菌的制备方法，其步骤是A、猪IFNa基因的获得根据NCBI蛋白数据库公布的猪IFNa蛋白序列(ID:CAA40477)，参考毕赤酵母密码子偏好性，设计猪IFNa全基因序列，并由上海invitrogen公司合成。B、IFNa-6XHis-bufforinIIPCR产物的获得以合成的猪IFNa核苷酸序列为模板，以pl(ATTGCTGCTA織AAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTATGGCTCCAACTTCTGCTTTCTT)和p2(ATCCTTTCTCAACAATCTATGAACTCTACCAACTGGAAATTGCAAACCAGCTCTAGAAGATCTAGTCTTATCATCATCATCTTCCTTCTTTCTCAATCTATCTTG)为引物，按50iU反应体系(ddH20:39ii1;dNTP(10mM):1.0ii1;10Xpfubuffer:5.0ii1;Oligoup(20pmol/ii1):1.5li1;01igodown(20pmo1/u1):1.5u1;模板(212ng):1.0u1;pfupolymarase:l.Oiil。)及反应程序(预变性95。C，3min;10个循环(变性95。C，45s;退火63。C，40s;延伸72°C，50s);22个循环(变性95°C，45s;退火55°C，40s;延伸72°C，50s)最后延伸72°C，10min)进行PCR扩增获得IFNa-6XHis-bufforinIIPCR产物。C、带同源臂的IFNa-6XHis-bufforinIIPCR产物的获得以IFNa-6XHis-bufforinIIPCR产物为模板，以pi和p3(AACTCAATGATGATGATGATGATGGTCGACGGCGCTATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTTATCATCATCATCCTTTCTCAACAATCTATGAAC)为引物，按50ii1反应体系(ddH20:39ii1;dNTP(10mM):1.Oil1;lOXpfubuffer:5.0li1;Oligoup(20pmo1/u1):1.5u1;Oligodown(20pmo1/u1):1.5u1;模板(212ng):1.Oil1;pfupolymarase:1.Oil1。)及反应程序(预变性95。C，3min;10个循环(变性95。C，45s;退火63。C，40sec;延伸72。C，50s);22个循环(变性95。C，45s;退火55t:，40s;延伸72°C，50s)最后延伸72°C，10min)进行PCR扩增获得带同源臂的IFNa-6XHis-bufforinIIPCR产物。D、表达盒PA0X1-aFactor-IFNa-6XHis-bufforinII_Zeocinr的获得把带同源臂的IFNa-6XHis-bufforinIIPCR产物和毕赤酵母外分泌pPICZAa质粒共电转入大肠杆菌E.coliYZ2005中，然后利用菌落PCR和核苷酸测序筛选出质粒pPICZAa-IFNa-6XHis_bufforinII，最后应用SacI酶切后得到表达盒PA。X1_aFactor-IFNa_6XHis_bufforinIl-Zeocin1^E、工程菌的构建采用电穿孔法(1500V/cm)将线性化的表达盒PA。X1_aFactor-IFNa-6XHis-bufforinII-Zeocinr导入PichiapastorisKM71H中。经PCR鉴定获得基因组上整合有表达盒P鹿「IFNa-6His-bufforinII_Zeocinr的工程菌PichiapastorisFZM2。。9。该菌株已保藏，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏日期2009年11月11日，保藏编号CCTCCNO:M209259，分类命名PichiapastorisFZM2。。9。该菌株形态学特性该菌菌落大而厚，湿润，表面光滑，不透明，乳白色，边缘十分圆整，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一。培养特性该菌可在固态或液态YPD培养基良好生长，在液态YPD中培养时，若接种量大或者培养时间长时可以形成明显菌球。生理特性Pichi即astorisFZM加。9属于甲醇营养型酵母属，能够利用甲醇作为碳源，具有AOX强启动子，基因组上整合有融合蛋白IFNa-bufforinII编码基因，在甲醇诱导下可以高量分泌表达IFNa-bufforinII融合蛋白。功能特性PichiapastorisFZM2。。9可连续高密度培养生产融合蛋白buforinII和INF-a，作为饲料添加剂或药物。实施例2:—种工程菌PichiapastorisFZM2。。9制备融合蛋白buforinII和INF-a方法，其步骤如下A、材料与溶液配制所用工程菌为本发明所提供PichiapastorisFZM2。。9。工程菌培养基为实验发酵优化培养基，各成分质量分数％:葡萄糖4%、氨水150iiL、KH2P040.7%、MgS04.7H20、0.03%FeS04.7H20、0.05%MnS04.H200.05%、0.1%P印tone，pH5.5，培养条件是30。C，每8h补加一次氨水，24h补加一次甲醇，O.4%PTM1(v/v)。PTM1配方为硫酸铜(CuS04)6g/L，碘酸钾(KI)O.08g/L，一水硫酸镁(MnS04H20)3g/L，二水合钼酸钠0.2g/L，硼酸(H3B03)0.02g/L，氯化锌(ZnCl2)20g/L，氯化钴0.5g/L，七水硫酸铁(FeS04.7H20)65g/L，生物素(Biotin)O.2g/L，硫酸(H2S04)5mL/L。B、一种融合蛋白buforinII和INF-a的制备方法，其步骤如下1)在含有100iig/mlZeocin的YPD平板上复苏PichiapastorisFZM2009;2)从复苏平板上挑单克隆于含有YPD培养基中，3(TC振摇(240rpm)培养17小时；3)将一体积培养17h的PichiapastorisFZM2。。9，接种于十体积优化发酵培养基中，30。C，260rpm，振摇培养4d;期间每8h补加0.15%氨水(v/v分析纯氨水)，24h补加1%甲醇(v/v分析纯)和0.4%PTM1(v/v);4)8000rpm(4。C)离心3min，获取上清；5)取10ill上清，进行SDS-PAGE电泳检测；6)上清液过分子筛凝胶柱，收集相应组分；7)冷冻干燥收集组分，得到融合蛋白buforinII和INF-a;8)用肠激酶酶切获得buforinII和IFNa，其比例为1:1;9)通过体外最小抑菌浓度试验表明buforinII和IFNa(比例为1:1)具有极好的抗菌性能(结果见表2)。通过断奶仔猪试验表明每kg日粮添加80-100mg融合蛋白抗菌肽buforinII和INF-a能降低腹泻率，也能提高断奶仔猪生长性能和免疫功能(结果见表3、4)。—种融合蛋白buforinII和INF-a在饲料中的应用过程是将干燥的融合蛋白buforinII和INF-a，直接与添加剂混合，再进一步配成全价饲料，应用于仔猪饲料中，融合蛋白buforinII和INF-a最终添加量为每kg饲料中含80mg_100mg融合蛋白buforinII禾口INF-a。表2融合蛋白buforinII和INF-a对各种病原菌的最小抑菌浓度浓度单位Pg/ml枯草芽胞杆菌藤黄八叠球菌金葡萄球菌克雷伯肺炎杆菌大肠杆菌沙门氏菌(G+)K3-2(G+)T3-2(G+)J3-3(G+)K3-4(G.)D3-3(G.)S2-l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3融合蛋白buforinII和INF-a对断奶仔猪生长性能的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表中同行肩注相同字母表示差异不显著(P>0.05)，相邻字母表示差异显著(P<0.05)，相间a字母表示差异极显著(P<0.01)。表4融合蛋白buforinII和INF-a对断奶仔猪血清免疫球蛋白浓度的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表中同行肩注相同字母表示差异不显著(P>0.05)，相邻字母表示差异显著(P<0.05)，相间字母表示差异极显著(P<0.01)。权利要求一种抗菌肽buforinII和猪INF-α融合表达毕赤酵母菌其特征在于毕赤酵母菌PichiapastorisFZM2009，CCTCCNOM209259。2.权利要求l所述的一种融合表达抗菌肽buforinII与猪INF-a的毕赤酵母工程菌的制备方法，其步骤是A、表达盒PA。xl-aFactor-IFNa-6XHis-bufforinII-Zeocinr的构建，首先以毕赤酵母偏好密码子人工设计合成猪干扰素a(IFNa)核苷酸序列，通过两次PCR扩增得到带同源臂PCR产物IFNa-6XHis-bufforinII;其次采用Red/ET同源重组技术将IFNa-6XHis_bufforinII克隆在pPICZAa载体或质粒上；第三是应用SacI酶切后得至Ll表达盒PA0X1_aFactor—IFNa_6XHis_bufforinII_Zeocinr;B、表达工程菌PichiapastorisFZM2。。9的构建，获得基因组整合有表达盒5，PA0X1_IFNa-6His-bufforinIl-Zeocin的过程为采用电穿孔法将线性化后表达盒P鹿「aFactor-IFNa-6XHis-bufforinII_Zeocinr的表达质粒导入PichiapastorisKM71H中，经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定得到基因组上整合有表达盒5，PA。xl_IFNa-6His-bufforinIl-Zeocin的工禾呈菌。3.权利要求l所述的一种融合蛋白buforinII和INF-a的制备方法，其步骤是A、材料与溶液配制工程菌培养基各成分质量分数％:葡萄糖4%、氨水150iiL、磷酸二氢钾0.7%，七水硫酸镁0.03%，七水硫酸铁0.05%，一水硫酸镁0.05%，蛋白胨0.1%，pH5.5;PTM1配方为硫酸铜6g/L，碘酸钾0.08g/L，一水硫酸镁3g/L，二水合钼酸钠0.2g/L，硼酸0.02g/L，氯化锌20g/L，氯化钴0.5g/L，七水硫酸铁65g/L，生物素0.2g/L，硫酸5mL/L;B、抗菌肽融合蛋白buforinII和INF-a的制备步骤是1)在含有100iig/mlzeocin的YPD平板上复苏PichiapastorisFZM2009;2)挑单克隆接种于含有YPD培养基中，3(TC振摇培养17h;3)将一体积培养17h的PichiapastorisFZM2。。9，接种于十体积发酵培养基中，30°C，260rpm，振摇培养4d;期间每8h补加0.15%v/v氨水，24h补加1%v/v甲醇禾口0.4%v/vPTM1;4)8000rpm，4。C离心3min，获取上清；5)取10iil上清，进行SDS-PAGE电泳检测；6)上清液过分子筛凝胶柱，收集组分；7)冷冻干燥收集的组分，得到融合蛋白buforinII和INF-a;8)用肠激酶酶切获得buforinII和IFNa。4.权利要求3所述的一种融合蛋白buforinII和IFNa在仔猪饲料中的应用。全文摘要本发明公开了一种抗菌肽buforinII和猪INF-α融合表达毕赤酵母菌及制备方法和应用，毕赤酵母菌(PichiapastorisFZM2009，CCTCCNOM209259)。其步骤是A、表达盒PAOX1-αFactor-IFNα-6×His-bufforinII-Zeocinr的构建；B、表达工程菌PichiapastorisFZM2009的构建，经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定得到工程菌。C、融合蛋白的制备步骤是1)在含有100μg/mlZeocin的YPD平板上复苏；2)挑单克隆接种于含有YPD培养基中，振摇培养；3)将一体积培养物接种于十体积发酵培养基培养；4)离心，获取上清；5)加一倍体积上样缓冲液上清中，电泳检测；6)上清液过分子筛凝胶柱，收集组分；7)冷冻干燥收集的组分，得到融合蛋白；8)用肠激酶酶切融合蛋白获得buforinII和IFNα。融合表达融合蛋白buforinII和INF-α应用猪饲料。方法易行、操作简便、表达量高、成本低廉、生物学活性强。文档编号A23K1/16GK101717737SQ20091027323公开日2010年6月2日申请日期2009年12月11日优先权日2009年12月11日发明者冯泽猛,印遇龙,唐志如,张友明申请人:中国科学院亚热带农业生态研究所