本发明属于植物生物技术领域，具体是一种以愈伤组织诱导白及四倍体的方法。
背景技术：
白及（Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.）又名白芨、别名紫兰，是兰科白及属多年生草本植物。其块茎为我国传统中药，其性微寒，味苦、甘，具收敛、化瘀止血、补肺生肌、消肿，用于治疗肺病、咳血、慢性胃溃疡、创伤出血和肝癌等症；为“快胃片”、“胃康宁”等中成药的重要组分。此外，白及在美容护肤、精细化工及观赏园艺等方面也有重要的应用价值。目前白及原料主要依赖野生自然资源，过度的采集和生境的破坏使资源数量急剧减少，濒临灭绝边缘。随着白及研究不断深入，应用日益广泛，市场需求量逐年增加，使得供需矛盾日益尖锐，价格持续上扬，已达400～500元∕kg。因此，白及人工栽培势在必行。在自然条件下，由于白及的种子细小且无胚乳，萌发率极低。人们主要通过采集本地的野生白及以分株繁殖方式繁育种苗，存在品种混杂、繁殖系数低、种质退化严重等诸多问题。而培育优质高产白及品种是人工栽培获得成功的关键所在。植物多倍体具有植株“巨型性”、有效成分含量高、抗逆性强等特性，成为了提高药用植物品质、产量和抗逆性的重要育种途径。如四倍体粉葛比野生二倍体生物产量提高十几倍；杭白芷多倍体药用成分欧前胡素含量比原植物高2倍。由此可见，多倍体是增产效应和药用成分含量得以大幅提高两个方面的完美结合的统一体，非常适合药用部位为块根、块茎以及全株的药用植物。我国先后培育出了牛膝、丹参、菘蓝、党参等30多个中药多倍体新品种。目前，利用化学诱导剂对白及种子进行多倍体诱导研究已有报道，因白及种子细小，在诱导后进行清洗时，种子悬浮于水中，虽然可以通过离心方式解决，但由于白及种子必须在培养基上才能萌发，而反复在超净工作台和离心机之间进行清洗工作，使种子污染率大幅增加，严重时会因整个处理全部污染而导致试验失败。
技术实现要素：
本发明针对白及种子进行多倍体诱导过程中存在的问题，利用白及愈伤组织进行白及四倍体诱导。本发明以愈伤组织诱导白及四倍体的方法，包括以下步骤：（1）在超净工作台上，将白及愈伤组织切分成0.3cm×0.3cm的小块，接入增殖培养基中培养10d；在无菌条件下，往培养瓶中加入灭菌过的化学诱导剂，化学诱导剂浸泡愈伤组织8～24h；所述的化学诱导剂为：0.05～0.2%秋水仙素+3%DMSO；所述增殖培养基为：N6+2,4-D1.0mg/L+NAA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L，pH6.0；经过诱导的白及愈伤组织细胞通透性增加，N6中的钾元素可调节细胞内适宜渗透压和酸碱平衡，参与细胞内糖和蛋白质代谢，N6与植物生长调节剂共同作用，促进诱导过的白及愈伤组织细胞的修复和生长。（2）在超净工作台上，将步骤（1）中的愈伤组织取出，放入无菌水中清洗，用无菌滤纸吸干水，接入分化培养基中培养，22～30d产生芽点，36～43d形成芽，55～65d芽长出2～3片叶，芽粗壮，叶色绿色；所述分化培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+ZT0.5mg/L+NAA0.5mg/L，pH6.0；ZT与6-BA具有促进白及愈伤组织细胞的分裂与分化作用，与NAA同时使用，有利于提高分化频率。（3）在超净工作台上，将步骤（2）中得到的芽接入生根培养基中培养，7d时芽的下端出现突起，12～16d开始长根，45～50d根长约为1.0cm；所述生根培养基为：1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+KT0.4mg/L，pH6.0；该培养基中的NAA具有诱导不定根的作用，IBA具有促进不定根的生长，两生长素使用具协同作用，提高根的数量和质量，KT具有促进细胞横向增粗，使苗粗壮，与生长素同时使用提高苗的质量。（4）上午9～11点，在超净工作台上，将步骤（3）中的白及小苗小心取出，放在灭菌过的盘子里，切下0.5～1.0cm长的根尖，将根尖立即放入预处理液中，处理3h，将小苗上剩余的根系切除，再接入生根培养基中培养，并将根尖与小苗编号；所述的预处理液为：0.1%秋水仙素溶液。（5）将步骤（4）中的预处理液中的根尖取出，用蒸馏水清洗后以卡诺氏固定液固定3h，将固定好的根尖用蒸馏水清洗，放入盛有1N盐酸（浓盐酸：水=1：11）的小烧杯中，在60℃左右的水浴锅中处理15～20min，水浴完毕后蒸馏水清洗，切除根冠，留下根尖分生区，以改良品红染色20min，将染色后的根尖分生区置于干净载玻片上，加入一滴蒸馏水，将根尖弄碎，盖上玻片后再加盖一张吸水纸用大拇指轻压，最后敲击直到根尖分散成雾状；（6）将步骤（5）中做好的载玻片的根尖在显微镜下镜检，将染色体数量为64条的小苗的编号和数量记录下来；统计白及四倍体诱导率为2.6%～23.4%。通过查阅资料得知，白及二倍体的染色体数为32条，所以染色体为64条的小苗为四倍体植株。所述愈伤组织增殖培养、分化培养及生根培养阶段的培养条件是：培养温度为25±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500Lx。所述培养基中，MS和N6均为基本培养基，2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，6-BA为苄氨基嘌呤，TDZ为噻重氮苯基脲，IBA为吲哚-3-丁酸，NAA为a-萘乙酸，ZT为玉米素，KT为激动素，试剂均为分析纯，水为蒸馏水。所述化学诱导剂中，DMSO为二甲基亚砜，水为蒸馏水。本发明利用白及愈伤组织进行白及四倍体诱导。愈伤组织是外植体的增生细胞产生的一团不规则、疏松的薄壁细胞，细胞增殖速度快，在培养基的作用下具有很强的分生能力和再分化能力，因此，在培养期间，大量细胞处于分裂期。化学诱导剂由秋水仙素和DMSO组成，DMSO具有极强的渗透性，有助于药物向细胞中渗透，同时也是渗透性的保护剂，改变生物膜对毒性物质的通透性，利于有毒物质的排泄。利用化学诱导剂对愈伤组织进行短时间诱导处理，既可以提高四倍体的诱导率，又能减少化学诱导剂对细胞毒害作用。根据细胞全能性原理，再分化过程中，一个细胞分化为一个植株，可有效减少杂合体的发生。因此，该方法具有操作简单、易控制、重复性好、诱导率高、多倍体的纯化率好等优点。附图说明图1为本发明实施例1～3中白及四倍体染色体数目显微放大示意图2n=4x=64。具体实施方式下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。实施例1一种以愈伤组织诱导白及四倍体的方法，包括以下步骤：（1）在超净工作台上，将愈伤组织切分成0.3cm×0.3cm的小块，接入增殖培养基中培养10d；在无菌条件下，往培养瓶中加入灭菌过的化学诱导剂，化学诱导剂浸泡愈伤组织24h；所述的化学诱导剂为：0.05%秋水仙素+3%DMSO；所述增殖培养基为：N6+2,4-D1.0mg/L+NAA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L，pH6.0；（2）在超净工作台上，将步骤（1）中的愈伤组织取出，放入无菌水中清洗5次，在无菌滤纸上吸干水，接入分化培养基中培养，22d产生芽点，36d形成芽，55d芽长出2～3片叶，芽细弱，叶色黄绿色；所述分化培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+ZT0.5mg/L+NAA0.5mg/L，pH6.0；（3）在超净工作台上，将步骤（2）中的芽接入生根培养基中培养，7d时芽的下端出现突起，12d开始长根，45d根长为1.0cm；所述生根培养基为：1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+KT0.4mg/L，pH6.0；（4）上午9～11点，在超净工作台上，将步骤（3）中的白及小苗小心取出，放在灭菌过的盘子里，切下约0.5cm长的根尖，将根尖立即放入预处理液中，处理3h，将小苗上剩余的根系切除，再接入生根培养基中培养，并将根尖与小苗编号；所述的预处理液为：0.1%秋水仙素溶液；（5）将步骤（4）中的预处理液中的根尖取出，用蒸馏水清洗后以卡诺氏固定液固定3h，将固定好的根尖用蒸馏水清洗，放入盛有1N盐酸（浓盐酸：水=1：11）的小烧杯中，在60℃左右的水浴锅中处理15～20min，水浴完毕后蒸馏水清洗，切除根冠，留下根尖分生区，以改良品红染色20min，将染色后的根尖分生区置于干净载玻片上，加入一滴蒸馏水，用镊子将根尖弄碎，盖上玻片后再加盖一张吸水纸用大拇指轻压，最后用铅笔的橡皮头敲击，直到根尖分散成雾状；（6）将步骤（5）中做好的载玻片的根尖在显微镜下镜检，纪录染色体为64条的小苗的编号和数量，统计该处理的白及四倍体诱导率为2.6%。实施例2（1）在超净工作台上，将愈伤组织切分成0.3cm×0.3cm的小块，接入增殖培养基中培养10d；在无菌条件下，往培养瓶中加入灭菌过的化学诱导剂，化学诱导剂浸泡愈伤组织8h；所述的化学诱导剂为：0.2%秋水仙素+3%DMSO；所述增殖培养基为：N6+2,4-D1.0mg/L+NAA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L，pH6.0；（2）在超净工作台上，将步骤（1）中的愈伤组织取出，放入无菌水中清洗5次，用无菌滤纸吸干水，接入分化培养基中培养，部分愈伤组织变黑，诱导出芽的时间长，30d产生芽点，43d形成芽，65d芽长出2～3片叶，芽细弱和粗壮两极分化，叶色黄绿色和深绿色；所述分化培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+ZT0.5mg/L+NAA0.5mg/L，pH6.0；（3）在超净工作台上，将步骤（2）中得到的芽接入生根培养基中培养，7d时芽的下端出现突起，16d开始长根，50d根长为1.0cm；所述生根培养基为：1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+KT0.4mg/L，pH6.0；（4）上午9～11点，在超净工作台上，将步骤（3）中的白及小苗小心取出，放在灭菌过的盘子里，切下根尖的0.5cm，将根尖立即放入预处理液中，处理3h，将小苗上剩余的根系切除，再接入生根培养基中培养，并将根尖与小苗编号；所述的预处理液为：0.1%秋水仙素溶液；（5）将步骤（4）中的预处理液中的根尖取出，用蒸馏水清洗后以卡诺氏固定液固定3h，将固定好的根尖用蒸馏水清洗，放入盛有1N盐酸（浓盐酸：水=1：11）的小烧杯中，在60℃左右的水浴锅中处理15～20min，水浴完毕后蒸馏水清洗，切除根冠，留下根尖分生区，以改良品红染色20min，将染色后的根尖分生区置于干净载玻片上，加入一滴蒸馏水，用镊子将根尖弄碎，盖上玻片后再加盖一张吸水纸用大拇指轻压，最后用铅笔的橡皮头敲击，直到根尖分散成雾状；（6）将步骤（5）中做好的载玻片的根尖在显微镜下镜检，纪录染色体为64条的小苗编号和数量，统计该处理的白及四倍体诱导率为10.8%。实施例3（1）在超净工作台上，将愈伤组织切分成0.3cm×0.3cm的小块，接入增殖培养基中培养10d；在无菌条件下，往培养瓶中加入灭菌过的化学诱导剂，化学诱导剂浸泡愈伤组织16h；所述的化学诱导剂为：0.1%秋水仙素+3%DMSO；所述增殖培养基为：N6+2,4-D1.0mg/L+NAA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L，pH6.0；（2）在超净工作台上，将步骤（1）中的愈伤组织取出，放入无菌水中清洗5次，用无菌滤纸吸干水，接入分化培养基中培养，25d产生芽点，40d形成芽，60d芽长出2～3片叶，芽粗壮，叶色深绿色；所述分化培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+ZT0.5mg/L+NAA0.5mg/L，pH6.0；（3）在超净工作台上，将步骤（2）中得到的芽接入生根培养基中培养，7d时芽的下端出现突起，15d开始长根，48d根长为1.0cm；所述生根培养基为：1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+KT0.4mg/L，pH6.0；（4）上午9～11点，在超净工作台上，将步骤（3）中的白及小苗小心取出，放在灭菌过的盘子里，切下0.5cm长的根尖，将根尖立即放入预处理液中，处理3h，将小苗上剩余的根系切除，再接入生根培养基中培养，并将根尖与小苗编号；所述的预处理液为：0.1%秋水仙素溶液；（5）将步骤（4）中的预处理液中的根尖取出，用蒸馏水清洗后以卡诺氏固定液固定3h，将固定好的根尖用蒸馏水清洗，放入盛有1N盐酸（浓盐酸：水=1：11）的小烧杯中，在60℃左右的水浴锅中处理15～20min，水浴完毕后蒸馏水清洗，切除根冠，留下根尖分生区，以改良品红染色20min，将染色后的根尖分生区置于干净载玻片上，加入一滴蒸馏水，用镊子将根尖弄碎，盖上玻片后再加盖一张吸水纸用大拇指轻压，最后用铅笔的橡皮头敲击，直到根尖分散成雾状；（6）将步骤（5）中做好的载玻片的根尖在显微镜下镜检，纪录染色体为64条的小苗编号和数量，统计该处理的白及四倍体诱导率为23.4%。