一种带叶兜兰的组织培养快速繁殖方法与流程

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体而言，本发明涉及一种带叶兜兰组织培养快速繁殖的方法、一种适于带叶兜兰组织培养快速繁殖的培养基体系以及一种确定带叶兜兰果荚最佳采集期的方法。

背景技术：

兜兰属(Paphiopedilum)是兰科最原始的属之一。与一般的兰花比较，兜兰属植物花的结构有巨大的变化，唇瓣呈半椭圆形的兜状，形状很特别，故名兜兰；又因其形状酷似旧时欧洲少女的拖鞋，又名拖鞋兰。但是由于近年来日益恶劣的生态环境、自身特殊的生物学特性以及人们的过度性采挖，兜兰植物现已成为世界上濒危的植物物种之一，许多种类已濒临灭绝，所有兜兰野生种均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录I而被禁止交易(卢思聪,《中国兰与洋兰》,金盾出版社,1994；郎楷永,“中国的兜兰”,《科技导报》,2002,20(9):56+2+65-66；曾宋君等，“兜兰无菌播种和组织培养研究进展”,《园艺学报》,2007,34(3):793-796)。因此兜兰属植物的保护工作以及繁育研究越来越受到人们的重视。

带叶兜兰(Paphiopedilum hirsutissimum(Lindl.ex Hook.))原产我国广西、贵州、云南等地，越南、老挝和泰国也有分布。叶片亮绿如带，花大且花期长，在野外常常成丛成片分布。在引种的过程中，发现与其它兜兰相比，带叶兜兰适应性强、生长快、自我繁殖能力强、观赏价值高，具有很高的应用前景。

和其他兰花一样，带叶兜兰种子没有胚乳，野外与真菌共生才能萌发。兰花主要靠组培苗进行繁殖，其组培苗的数量约占观赏植物组培苗总量的40％(熊丽等,《观赏花卉的组织培养与大规模生产》,化学工业出版社,2003)。但是，兜兰的组织培养技术难度极大(王代谷等，“贵州兜兰属植物的现状及展望”,《安徽农业科学》,2009,37(6):2469-2470)，是兰科中最难的属之一。随着组织培养技术的发展和研究的深入，近几年取得了一定的进展，但是通过组织培养技术进行兜兰的商业化大规模生产的技术路线仍未达到十分成熟。

如何以简便易行的操作技术进行低成本的大规模生产对挽救濒临灭绝的带叶兜兰及其开发利用具有重要意义。因此，有必要提供一种带叶兜兰的快速繁殖体系，以缩短其培养周期、提高种苗成活率和幼苗质量、降低成本，从而满足市场对这一观赏花卉不断增长的需求。

技术实现要素：

为了解决上述问题和克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种带叶兜兰组织培养快速繁殖的方法、一种适于带叶兜兰组织培养快速繁殖的培养基体系以及提供了带叶兜兰果荚的最佳采集期。

本发明的第一方面提供了一种带叶兜兰组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)自交授粉：选择花大色艳的带叶兜兰进行异花授粉；

(2)果荚采摘：在带叶兜兰自交后120-195天左右采集果荚；

(3)无菌播种：以采集的果荚为外植体进行消毒，切开果荚将种子接种在萌发培养基中进行暗培养大约40-50天，待30％种子长出原球茎，转为光照周期为12h培养；

(4)增殖继代培养：将步骤(3)中产生的幼苗接种到增殖培养基中，每4周继代一次，增值率达3倍；

(5)生根壮苗培养：将步骤(4)中增殖培养大约8周的、生长健壮的2cm左右的幼苗转接到生根壮苗培养基中进行培养；

(6)生根苗移栽：在步骤(5)中的幼苗培养大约4周后，将根系生长良好的植株转移到自然光下炼苗，然后将其移栽至基质中进行培养。

在一个优选的实施方式中，在本发明的方法中使用的所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶或所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/L NAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

在一个实施方式中，在本发明的方法中使用的所述增殖培养基为1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

在一个实施方式中，在本发明的方法中使用的所述生根壮苗培养基的成分及其含量与上述增殖培养基一样，即所述生根壮苗培养基为1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

在一个优选的实施方式中，在带叶兜兰自交后第100天左右、第120天左右、第150天左右、第165天左右、第195天或上述任意时间点之间的任意时间点采集果荚。例如，可以在带叶兜兰自交后第100天左右、第105天左右、第110天左右、第115天左右、第120天左右、第125天左右、第130天左右、第135天左右、第140天左右、第145天左右、第150天左右、第155天左右、第160天左右、第165天左右、第170天左右、第175天左右、第180天左右、第185天左右、第190天左右、第195天左右或上述任意时间点之间的任意时间点采集果荚。优选地，在带叶兜兰自交后第第100天左右到第120天左右、第120天左右到第135天左右、第120天左右到第150天左右或第120天左右到第165天左右的时间段采摘果荚，更优选地在带叶兜兰自交后第120天左右到第135天左右采摘果荚。优选地，在带叶兜兰自交后120天左右、135天左右、150天左右或165天左右采集果荚，更优选地在带叶兜兰自交后第120天左右采摘果荚。

在一个实施方式中，在本发明的方法中，培养室培养的温度为24±2℃，光照强度为1000-15001x，光照周期为12h；黑暗培养温度为24±2℃。

本发明的第二方面提供了一种用于带叶兜兰组织培养快速繁殖的萌发培养基，所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶或所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/L NAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

本发明的第三方面提供了一种用于带叶兜兰组织培养快速繁殖的培养基体系，其包含萌发培养基、增殖培养基和生根壮苗培养基，其中所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶或所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/L NAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

在一个实施方式中，本发明的培养基体系中的所述增殖培养基为1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

在一个优选的实施方式中，本发明的培养基体系中的所述生根壮苗培养基为1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

在一个优选的实施方式中，本发明的培养基体系是下面表1所示的培养基体系，表1列出了本发明培养基体系中的各种培养基的成分及其用量。

表1.带叶兜兰的离体培养基体系

注：表1中的生根壮苗培养基，既可作为一般生根壮苗培养基，也是本发明所指的可用来做长期继代的培养基。

定义

为了便于对本发明的理解，对上述各个方面中所用的培养基、培养基中所用到的植物激素进行定义。

本发明所使用的MS基本培养基是根据Murashige T.等(Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant,1962,15:473-497)配制的，其成分及各成分含量如下表2所示。1/2MS为MS基本培养基中大量元素减半，其他元素用量不变；1/5MS为MS基本培养基中大量元素减至五分之一，其他元素用量不变。

本文中培养基中的成分“NAA”是指萘乙酸。

表2.MS培养基各成分及含量

本发明的有益技术效果

本发明产生的积极效果是：

(a)本发明所采用的外植体可在某固定时间段大量集中获得并进行组织培养，打破了外植体不易获得且污染率高的限制；

(b)本发明确定了带叶兜兰最佳果荚采收时间，发芽率最高，且种苗生长强壮；

(c)本发明还提供了适于带叶兜兰离体快繁的培养基体系，包括萌发培养基、增殖培养基和生根壮苗培养基，培养基配方简单，离体快繁的操作流程简洁易操作，生产低成本，可进行商业化大规模生产。

前述内容仅仅是示意性的并且决不旨在是限制性的。除了上述示意性方面、实施方式和特征，通过参考下述详细说明，进一步的方面、实施方式和特征将更容易被理解。

附图简述

通过参考下述附图，本发明的进一步的方面、特征将更容易被理解。本领域技术人员应该理解，这些附图仅示意性地阐述了根据本发明的一些实施方式，而不应将其视为是对本发明范围的限制。

图1示出了带叶兜兰野外生长、温室驯化、开花和果荚的图像。

图2示出了带叶兜兰授粉后120天和150天的种子的图像。

图3示出了不同时期(从120天到195天)采摘的果荚在培养基(1)和培养基(2)中分别培养8周和16周后种子的萌发率，其中培养基(1)为1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶，培养基(2)为1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/L NAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

图4示出了根据本发明一个方面的带叶兜兰的组织培养过程图。

图5示出了根据本发明一个方面的带叶兜兰组培快繁技术体系的流程图。

图6示出了带叶兜兰的出瓶炼苗情况。

具体实施方式

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。

实施例1.带叶兜兰自交授粉和果荚最佳采摘期的确定

实验材料：带叶兜兰获取自中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室；本发明所有实施例中使用的各种试剂或培养基成分均经商购获得。

选择花大色艳的带叶兜兰进行人工异花授粉，授粉后生长得到果荚。

授粉后，分别在第120天、第135天、第150天、第165天、第180天以及第195天收集果荚。

将上述果荚分别用自来水洗净后，置于10％次氯酸钠溶液中消毒20分钟，用70％酒精表面消毒30秒，再以0.1％升汞消毒10分钟，最后用无菌水冲洗5次。将洗净的果荚切开，将种子分别接种于两种萌发培养基(培养基(1)和培养基(2))上行进行暗培养40天，待30％种子长出原球茎，转为光照周期为12h培养。培养8周或16周后，测量种子萌发率。

培养基(1)为1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶，培养基(2)为1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/L NAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。培养条件为：培养室培养的温度为24±2℃，光照强度为1000-15001x，光照周期为12h；黑暗培养温度为24±2℃。

结果发现，授粉后120天采集的种子在培养基(2)培养16周后，萌发率达到67.56％，低于相同条件下培养基(1)的萌发率71.44％。此后，种子萌发率均随种子成熟度上升而下降，呈负相关。授粉后135天采集的种子和150天采集的种子培养16周后在培养基(1)中的萌发率低于培养8周后在培养基(2)上的萌发率。在授粉后135天之后，在培养相同时间的情况下，种子在培养基(2)上的萌发率均高于培养基(1)。由此可看出，带叶兜兰最适宜萌发的时间可能在授粉后120天或之前，但后期发现165d的种子生长更旺盛，这可能是因为种子营养物质的储备需要一定的时间，初期种子的徒长可能会降低后期的长势(见图2-3)。

实施例2.带叶兜兰种子的组织培养快速繁殖

如附图4-6所示，本发明的带叶兜兰种子的组织培养快速繁殖方法包括如下步骤：

1、自交授粉：选择花大色艳的带叶兜兰进行异花授粉；

2、果荚采摘：在带叶兜兰自交后120天左右采集果荚；

3、无菌播种：按照实施例1中所述的方法以采集的果荚为外植体进行消毒，切开果荚将种子接种在萌发培养基(实施例1中的培养基(1))中进行暗培养40天，待30％种子长出原球茎，转为光照周期为12h培养，种子萌发率可达71.44％；

4、增殖继代培养：将步骤3中产生的幼苗接种到增殖培养基中，每4周继代一次，增值率达3倍，其中增殖培养基为1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶；

5、生根壮苗培养：将步骤4中增殖培养8周的、生长健壮的2cm左右的幼苗转接到生根壮苗培养基中进行培养，其中生根壮苗培养基为1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶；

6、生根苗移栽：在步骤5中的幼苗培养4周后，将根系生长良好的植株转移到自然光下炼苗，然后将其移栽至基质中进行培养，成活率可达95％。

实施例3.带叶兜兰种子的组织培养快速繁殖

如附图4-6所示，本发明的带叶兜兰种子的组织培养快速繁殖方法包括如下步骤：

1、自交授粉：选择花大色艳的带叶兜兰进行异花授粉；

2、果荚采摘：在带叶兜兰自交后150天左右采集果荚；

3、无菌播种：采用上述培养基(2)按照实施例2所述的方法进行无菌播种，种子萌发率达53.89％；

4、增殖继代培养：按照实施例2所述的方法进行增殖继代培养；

5、生根壮苗培养：按照实施例2所述的方法进行生根壮苗培养；

6、生根苗移栽：在步骤5中的幼苗培养4周后，将根系生长良好的植株转移到自然光下炼苗，然后将其移栽至基质中进行培养，成活率可达95％。

实施例4.带叶兜兰种子的组织培养快速繁殖

如附图4-6所示，本发明的带叶兜兰种子的组织培养快速繁殖方法包括如下步骤：

1、自交授粉：选择花大色艳的带叶兜兰进行异花授粉；

2、果荚采摘：在带叶兜兰自交后165天左右采集果荚；

3、无菌播种：采用上述培养基(2)按照实施例2所述的方法进行无菌播种，种子萌发率接近51.56％；

4、增殖继代培养：按照实施例2所述的方法进行增殖继代培养；

5、生根壮苗培养：按照实施例2所述的方法进行生根壮苗培养；

6、生根苗移栽：在步骤5中的幼苗培养4周后，将根系生长良好的植株转移到自然光下炼苗，然后将其移栽至基质中进行培养，成活率可达95％。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到其各种变化或替换，这些都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。