专利名称：调控神经干细胞分化相关基因表达的方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程和发育生物学，涉及神经干细胞分化发育相关基因的遗传工程，以及利用反义RNA和RNA干扰等技术，以神经干细胞分化发育相关基因及其产物作为干预干细胞分化发育的靶标，从而调控神经干细胞分化发育。
背景技术：
神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，并能进行自我更新、足以提供脑组织细胞的可再生细胞。在哺乳动物中枢神经系统发育，保持中枢神经系统的功能具有重要作用。神经干细胞分化是一个极为复杂的过程。影响神经干细胞分化的因子很多，如CNTF能促进神经干细胞分化为胶质细胞，而BDNF则促进分化为神经元。我们先前发现了神经干细胞分化过程中特异表达的基因。特异性干预这些基因的表达的技术，对于研究这些基因的具体功能，以及特异性调控这些基因的表达，从而调节神经干细胞的发育、分化，非常重要。
由于神经干细胞固有的体外分离培养困难的特点，目前对其所做的报道往往局限在分离培养技术上。还缺乏其他调控神经干细胞分化发育相关基因的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供调控神经干细胞发育过程中的特异表达基因的技术。本发明的另一目的在于利用这些技术调控神经发育。
本发明包括下列步骤分离和培养神经干细胞；以神经干细胞发育分化过程中特异表达的基因及其产物为靶标，合成特异的核酸片段；以这些合成的核酸片段干预神经干细胞的分化发育；研究调控的效果。具体的包括以下的方案神经干细胞单克隆的获得和细胞培养浓度的确定无菌条件下取E14的SD胎鼠的纹状体，机械法将组织吹打成单细胞悬液，将初始细胞浓度设置为1×107个/毫升，然后在96孔培养板中进行梯度稀释，使用完全培养液，每孔100加入微升，设置12个复孔，以5倍梯度稀释8次，放于37度5％CO2条件下培养，并连续观察两个星期。
观察结果发现，当细胞的初始浓度大于106个/毫升时，细胞不仅在孔底部成连片生长，而且在培养液中形成大量的悬浮细胞团，且细胞团的体积较大。当细胞的初始浓度约在105个/毫升时，细胞在底部连片生长，只形成较少的悬浮细胞团，且细胞团的体积较小；将细胞的初始浓度进一步降低时，则观察到单个的细胞、小片贴壁的细胞团和较小的悬浮细胞团，且它们之间的距离常常相隔较远。
用于转化实验的细胞的培养无菌条件下取胎鼠的纹状体，将组织吹打成单细胞悬液，以3×105个/毫升的细胞浓度，将细胞种植在添加了EGF和bFGF的基础培养液中，然后将装有培养细胞的培养瓶置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。培养一周后，弃去原先的的培养液，换入新的完全培养液。以后以同样方法每周更换一次培养液，即可获得处于贴壁状态下生长的神经干细胞。用此法对神经干细胞进行传代可连续传代6个月以上。
细胞形态的观察将不同培养时期的细胞培养物置于倒置显微镜下直接观察拍照。
用间接免疫荧光细胞化学法鉴定神经干细胞①原理已知抗体或抗原用荧光素做标记物，检查细胞或组织标本上相应的抗原或抗体，在荧光显微镜下，由于抗原抗体特异性结合，结合部位的荧光素因受激发光照射而发出明亮的荧光。从标记物存在的位置和数量，可确定在组织细胞中的定位和分布。常见的标记荧光素有异硫氰酸(FITC)和四乙基罗丹明(RB200)，前者发出荧光波长为490-619纳米(黄绿色荧光)。后者发射荧光波长为540-660纳米(橙红色荧光)。FITC和RB200常用于标记免疫荧光蛋白Ig。
②方法采用本领域一般技术人员熟悉的技术进行鉴定。
RNAi实验线性DNA模板的制备
将上步制得的质粒分别采用EcorRI和XhoI单酶切，酶切体系如下EcorRI单酶切Y+/TanqoTMBuffer 4微升样品DNA5微升EcorRI 0.5微升水 11.5微升XhoI单酶切Y+/TanqoTMBuffer4微升样品DNA5微升XhoI 0.5微升水 11.5微升将上述酶切体系混匀后置于37度温育1小时。
凝胶电泳及条带回收用前述同样的方法进行电泳，琼脂糖凝胶的浓度为1.0％，将酶切液电泳证实质粒已被切开后，采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA。
RNA的合成(1)将贮存于-20度的MEGAscriptTMT3和T7试剂盒取出，将其中的T3和T7 RNA聚合酶取出直接置于冰上，四种核苷酸溶液(ATP，CTP，GTP和UTP)完全溶解后置于冰上，10*反应缓冲液则溶解后置于室温，至实验结束放回-20度。
(2)按下述配方组装20微升的反应体系无菌双蒸水 4微升ATP 2微升CTP 2微升GTP 2微升
UTP2微升10*反应缓冲液 2微升切胶回收的DNA样品 4微升T3(或者T7)RNA聚合酶2微升要注意按上述次序加入各成分。T7 RNA聚合酶对应EcorRI单酶切制得的线性DNA片断，T3 RNA聚合酶对应XhoI单酶切制得的线性DNA片断。
(3)将上述体系组装好以后，轻轻混匀，短暂离心以使液体滞留在管底，然后将管置于37度下温育4小时。
RNA的回收采用市场上可以购买的试剂盒。按操作说明书进行。
RNA的复性将每种外源DNA片断对应的两个单链RNA片断等量置于一起，充分混匀后，置于5升水中，升温至90度并保持4分钟，然后使其自然而缓慢的冷却至室温(约需4-5个小时)，然后将所得双链RNA保存在-20度。
反义RNA抑制人工合成这三个小序列，并将其导入细胞，即可达到抑制对应基因表达的效果。
转化实验在获得了dsRNA和人工合成了反义DNA片断之后，即可进行转化实验，将这些片断导入神经干细胞，观察神经干细胞发生的变化。
技术效果通过上述技术，我们成功地调控了与神经干细胞发育和分化有关基因的表达。
具体实施例方式
神经干细胞单克隆的获得和细胞培养浓度的确定无菌条件下取E14的SD胎鼠的纹状体，机械法将组织吹打成单细胞悬液，将初始细胞浓度设置为1×107个/毫升，然后在96孔培养板中进行梯度稀释，使用完全培养液，每孔100加入微升，设置12个复孔，以5倍梯度稀释8次，放于37度5％CO2条件下培养，并连续观察两个星期。
观察结果发现，当细胞的初始浓度大于106个/毫升时，细胞不仅在孔底部成连片生长，而且在培养液中形成大量的悬浮细胞团，且细胞团的体积较大。当细胞的初始浓度约在105个/毫升时，细胞在底部连片生长，只形成较少的悬浮细胞团，且细胞团的体积较小；将细胞的初始浓度进一步降低时，则观察到单个的细胞、小片贴壁的细胞团和较小的悬浮细胞团，且它们之间的距离常常相隔较远。
根据观察结果，我们认为在细胞初始浓度很低时我们得到的细胞团就是神经干细胞的单克隆。随着细胞初始浓度的升高，细胞团之间由于间隔较小而倾向于粘附在一起，形成较大的细胞团。经随后的免疫实验证实，那些贴壁的细胞和细胞团也是神经干细胞。考虑到转化实验的需要，我们将细胞浓度设置在3×105个/毫升左右，这样既不会因为细胞密度太大，形成的细胞团太大太多而影响实验观察和转化效率，也不会因为细胞密度太低而使获得的细胞数量太少影响观察效果。
不同细胞因子浓度对神经干细胞原代培养的影响无菌条件下取E14的SD胎鼠的纹状体，机械法将组织吹打成单细胞悬液，细胞的种植浓度为3×105个/毫升，基础培养液的组成为DMEM/F12(1∶1，v/v)，100u·mL-1的青霉素和链霉素，1％的B27。然后在下列不同浓度因子的条件下种植到96孔培养板中(每个条件设置8个复孔)，并置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
①不同的bFGF浓度对原代细胞生长的影响培养液为基础培养液分别加入bFGF至终浓度为0，0.1，0.5，1，5，10，20，30，40，50纳克/毫升，培养一周后观察不同浓度的因子对细胞增殖的影响。
②不同的EGF浓度对原代细胞生长的影响培养液为基础培养液分别加入EGF至终浓度为0，0.1，0.5，1，5，10，20，30，40，50纳克/毫升，培养一周后观察不同浓度的因子对细胞增殖的影响。
③不同条件对神经干细胞继代培养的影响原代培养一周后，收集细胞，用枪头吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度为3×105个/毫升，然后重复前述操作。
经过以上实验，我们发现神经干细胞对EGF和bFGF都具有反应性，这两种细胞因子都可以刺激神经干细胞的生长，刺激强度呈浓度相关性。对这两种细胞因子而言，当其浓度低于20纳克/毫升时，可以明显的观察到细胞的生长情况随细胞因子的浓度增加而增加；当其浓度高于20纳克/毫升时，可以明显的观察到细胞的生长情况随细胞因子的浓度增加而减弱。用继代培养的细胞所做的实验同样观察到这一现象。因而认为这两种细胞因子浓度为20纳克/毫升时是适合细胞培养的最佳浓度。在实验当中，由于bFGF的供货较慢，我们采用了10纳克/毫升的浓度来作培养，而EGF采用了20纳克/毫升的浓度。
用于转化实验的细胞的培养无菌条件下取E14的SD胎鼠的纹状体，机械法将组织吹打成单细胞悬液，以3×105个/毫升的细胞浓度，将细胞种植在添加了20纳克/毫升EGF和10纳克/毫升bFGF的基础培养液中，然后将装有培养细胞的培养瓶置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。培养一周后，弃去原先的的培养液，换入新的完全培养液。以后以同样方法每周更换一次培养液，即可获得处于贴壁状态下生长的神经干细胞。用此法对神经干细胞进行传代可连续传代6个月以上。
细胞形态的观察将不同培养时期的细胞培养物置于倒置显微镜下直接观察拍照，如图I。可见在体外培养情况下，神经干细胞呈多形性，有圆形、扁平状、梭状、树枝状等等，且易于形成集落生长。并且我们也发现，悬浮细胞团和贴壁细胞团可以发生相互转化。悬浮细胞团在生长一段时间以后，常常伸出一些分支贴附在瓶壁上。而经过较长时间生长后，贴壁细胞团有时会整个的悬浮到培养液中。这些变化并没有伴随着其他条件的改变，原因也未见报道。
盖区域的半径大大超过细胞团的半径；C.多量的细胞散在生长，呈现出多种多样的形态，有些细胞聚集成团；D.细胞由一个嵴向外生长，中心无明显的细胞团。
用间接免疫荧光细胞化学法鉴定神经干细胞
②原理已知抗体或抗原用荧光素做标记物，检查细胞或组织标本上相应的抗原或抗体，在荧光显微镜下，由于抗原抗体特异性结合，结合部位的荧光素因受激发光照射而发出明亮的荧光。从标记物存在的位置和数量，可确定在组织细胞中的定位和分布。常见的标记荧光素有异硫氰酸(FITC)和四乙基罗丹明(RB200)，前者发出荧光波长为490-619纳米(黄绿色荧光)。后者发射荧光波长为540-660纳米(橙红色荧光)。FITC和RB200常用于标记免疫荧光蛋白Ig。
②方法(1)染色前将细胞种植到Poly-L-lysine包被的玻片上。Poly-L-lysine包被玻片的处理将载玻片置于0.5％的Hcl中，浸泡过夜，流水冲洗并用双蒸水清洗，高温灭菌，浸泡在多聚赖氨酸中并放于37度电热培养箱中2-3h，去除多余多聚赖氨酸，并用0.02摩尔/升PBS漂洗。
(2)染色当天，取出待染细胞，PBS漂洗两次，每次5分钟；(3)用4％多聚甲醛溶液室温固定20min，吸除固定液；(4)PBS漂洗两次，边洗边轻轻振荡，每次10分钟；(5)用含10％山羊血清和0.2％TritonX-100的0.02摩尔/升PBS封闭1h，然后用含1％山羊血清的0.02摩尔/升PBS洗一次；(6)加入一抗，常温下孵育2h。
(7)PBS漂洗三次，每次10min，除去未反应的非特异性吸附的抗体，减少背景染色。
(8)然后加入溶解在含1％山羊血清和0.025％叠氮化钠的0.02摩尔/升PBS中的连有FITC荧光素的相应的二抗，在黑暗中孵育30min。
(9)弃二抗，PBS漂洗三次，每次10min。
(10)甘油明胶封片，荧光显微镜下观察并拍照。
③免疫荧光染色结果如图II所示。据此我们认为在实验中获得的细胞就是神经干细胞，包括悬浮状态和贴壁状态，单个细胞和细胞团。
RNAi实验的准备在本实验中，我们采用了导入长链dsRNA的方法。下面首先介绍长链dsRNA的合成。
如图IV所示之pBluescriptII SK质粒，已知外源片断位于该质粒的EcorRI和XhoI酶切位点之间，我们在实验中采用EcorRI单酶切制得线性DNA片断，然后用T7 RNA聚合酶进行聚合，即可制得与外源片断序列相同，但长度略多几十个碱基的单链RNA片断。同时采用XhoI单酶切制得另一条线性DNA片断，然后用T3 RNA聚合酶进行聚合，即可制得与外源片断序列相同，但长度略多几十个碱基的与前述单链序列互补的单链RNA片断。将这两种单链RNA片断等量置于一起进行复性，即可制得与质粒中双链外源DNA片断序列相同的双链RNA片断(dsRNA，double-strand RNA)。在这个双链RNA片断的两端各有几十个碱基的单链，但这并不影响实验的结果。
线性DNA模板的制备将上步制得的质粒分别采用EcorRI和XhoI单酶切，酶切体系如下EcorRI单酶切Y+/TanqoTMBuffer 4微升样品DNA 5微升EcorRI 0.5微升水 11.5微升XhoI单酶切 Y+/TanqoTMBuffer 4微升样品DNA 5微升XhoI0.5微升水 11.5微升将上述酶切体系混匀后置于37度温育1小时。
凝胶电泳及条带回收用前述同样的方法进行电泳，琼脂糖凝胶的浓度为1.0％，将酶切液电泳证实质粒已被切开后，采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA。
胶回收步骤如下(1)用干净的手术刀割下含需回收DNA的琼脂块，放入1.5ml离心管中。琼脂块的体积应尽量小，但又尽量不要因此损失DNA。判定DNA片段的位置时，使用长波长紫外光，在紫外光下照射的时间应尽可能短。
(2)按每400μl/100mg琼脂糖凝胶的比例加入Binding Buffer，置于50～60℃水浴中10分钟，使胶彻底融化。加热融胶时，每2分钟混匀一次。加热的时间可以延长到15分钟，以保证胶全部融化。
(3)将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2分钟。8,000rpm室温离心1分钟。
(4)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500μl Wash Solution，8,000rpm室温离心1分钟。
(5)重复步骤4一次。
(6)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12,000rpm室温离心15秒。
(7)将UNIQ-10柱放入一根新的1.5-ml无菌离心管中，在柱子膜中央加30μl灭过菌的双蒸水，37℃放置2分钟。
(8)12,000rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段。RNA的合成(1)将贮存于-20度的MEGAscriptTMT3和T7试剂盒取出，将其中的T3和T7 RNA聚合酶取出直接置于冰上，四种核苷酸溶液(ATP，CTP，GTP和UTP)完全溶解后置于冰上，10*反应缓冲液则溶解后置于室温，至实验结束放回-20度。
(2)按下述配方组装20微升的反应体系无菌双蒸水 4微升ATP 2微升CTP 2微升GTP 2微升UTP 2微升10*反应缓冲液2微升切胶回收的DNA样品4微升T3(或者T7)RNA聚合酶 2微升要注意按上述次序加入各成分。T7 RNA聚合酶对应EcorRI单酶切制得的线性DNA片断，T3 RNA聚合酶对应XhoI单酶切制得的线性DNA片断。
(3)将上述体系组装好以后，轻轻混匀，短暂离心以使液体滞留在管底，然后将管置于37度下温育4小时。
RNA的回收(1)向每个20微升反应体系中加入25微升LiCl溶液(2)混匀后放于-20度冷冻1小时(3)然后在4度环境下以14000转/分钟离心15分钟，以沉淀RNA(4)小心的除去上清液，加入1毫升70％乙醇于4度洗涤双链RNA沉淀一次，然后在4度环境下以14000转/分钟离心15分钟，以便最大程度的去除未结合的单核苷酸。
(5)小心的除尽上清液，将双链RNA沉淀重悬于无菌双蒸水中，放-20度保存。
RNA的复性
将每种外源DNA片断对应的两个单链RNA片断等量置于一起，充分混匀后，置于5升水中，升温至90度并保持4分钟，然后使其自然而缓慢的冷却至室温(约需4-5个小时)，然后将所得双链RNA保存在-20度。
电泳观察dsRNA的合成结果制取1.2％的琼脂糖凝胶，制胶方法同前，但是在制胶之前预先将电泳槽和封好的凝胶灌制平台浸泡在0.1％的DEPC中并置于37度环境下过夜，在制胶前再用双蒸水将残留于电泳槽和制胶槽中的DEPC冲去，电泳结果如图V。
从图中可见，dsRNA片断的大小与将质粒进行EcorRI和XhoI双酶切所得片断的大小近似，且三个片断相互之间的相对位置相同，因而认为获得了正确的dsRNA片断。
反义RNA抑制的准备本实验采取直接将外源DNA小片断导入细胞的方法来达到反义RNA抑制的效果。
从Genbank查得NM_013389、AF155655、D45370的序列见附录I，它们在染色体上的位置如附录II所示，分别位于7p13(NM_013389)、12q23.2(AF155655)、10q23.2(D45370)，且都是单拷贝基因，对于沉默基因，研究该基因的功能提供了重要背景。
由于这些序列都是mRNA序列，根据读框，我们设计了20bp长的与mRNA序列互补的DNA片段，这些小片段可以与对应的mRNA前体5′端结合，从而抑制mRNA的加帽反应，加速mRNA的降解。
每个基因的对应DNA片段序列如下。
NM_013389GGC CTC CGC CAT CCC AGG TC；AF155655CGT CCT CAT CCA TCT CCT CA；D45370TTG CTT GCC ATG GCT TCG GG。
人工合成这三个小序列，并将其导入细胞，即可达到抑制对应基因表达的效果。
转化实验
在获得了dsRNA和人工合成了反义DNA片断之后，即可进行转化实验，将这些片断导入神经干细胞，观察神经干细胞发生的变化。
转化步骤(1)获取处于对数生长期的神经干细胞。
(2)将细胞从瓶壁上吹打下来，并继续吹打以获得尽可能多的单个细胞。
(3)用无菌的尼龙网过滤除去未吹打散的较大的细胞团，留下单个的细胞以及由较少细胞组成的小细胞团，以利于提高转化效率。
(4)将过滤液离心，离心速度1500转/分钟，离心时间5分钟，使溶液中的细胞沉淀。
(5)倒去上清液，并吸去残留瓶口的液滴，将细胞沉淀重悬于电转化缓冲液中。
(6)取10微升重悬液与等量0.4％台盼蓝混匀，置于血球计数板上，一分钟后计数。
(7)用2mm-gap的电击杯，每杯放入15微升的dsRNA或DNA样品。
(8)以每杯400微升放入细胞重悬液，稍加抖动以混匀，注意杯中不要产生气泡。
(9)将杯放入电转化仪中电击，电击条件为80伏特，脉冲时间为80微秒。
(10)电击完毕，将电击杯置于室温5分钟(11)用完全培养液将细胞稀释至4毫升，混匀，以1毫升/孔放入24孔细胞培养板中。
(12)将细胞置于37度5％CO2条件下培养。
电击实验中要注意细胞放在电转化缓冲液中的时间总计不能超过30分钟。细胞的浓度在实验一般控制在1×105个/毫升以上，但不宜超过1×106个/毫升。过高的细胞浓度对转化效率会带来负影响，且更重要的是影响以后的实验观察。对细胞的吹打次数不能太少，否则细胞多数处于成团状态，影响电击转化的效率。但是吹打次数过多又会给细胞带来损伤，影响细胞存活率。实验中采用台盼蓝染色计数即是为了观察细胞的损伤程度。在实验中细胞吹打后的存活率一般在90％以上。
dsRNA的转化结果按上述转化方法将三个基因的dsRNA片断转入神经干细胞，用双蒸水转化作为对照，转化后连续观察七天。经过多次转化实验，有时可观察到细胞贴壁现象增多，有时观察到贴壁现象减少，多数情况下观察不到变化。
反义RNA抑制的结果将前述人工合成的DNA短链导入神经干细胞，同样用双蒸水转化作为对照，转化后连续观察七天。我们观察到转化了AF155655的小片段的神经干细胞的贴壁现象明显增加，转化组与未转化组的比较如图VI所示(放大50倍)。转化D45370小片段的细胞则同样出现了上述变化，但是并无AF155655的片断引起的变化显著。而在转化了NM_013389的小片段的细胞中未观察到与对照组的区别。重复实验证实了上述现象并非随机出现。
将前述人工合成的DNA短链导入神经干细胞，同样用双蒸水转化作为对照，转化后连续观察七天。我们观察到转化了AF155655的小片段的神经干细胞的贴壁现象明显增加，转化组与未转化组的比较如图VI所示(放大50倍)。转化D45370小片段的细胞则同样出现了上述变化，但是并无AF155655的片断引起的变化显著。而在转化了NM_013389的小片段的细胞中未观察到与对照组的区别。重复实验证实了上述现象并非随机出现。
权利要求
1.一种调控与神经干细胞分化发育相关基因表达的方法，该方法包括下列步骤a选择拟调控的基因；b根据拟调控基因序列，设计、合成相应的核酸片段；c单独用合成的序列或者包含该序列的载体转化所需要调控的宿主细胞；d检验调控的效果。
2.权利要求1所述的方法，其中调控的基因是AF155655。
3.权利要求1所述的方法，其中调控的基因是D45370。
4.权利要求1所述的方法，其中调控技术主要利用RNA干扰。
5.权利要求1所述的方法，其中调控技术主要利用反义RNA。
全文摘要
本发明提供了调控与神经干细胞分化发育有关的基因表达的技术。本发明也提供了钙技术相应的表达载体、核酸序列。本发明提供了实施该技术的详细步骤。
文档编号C12N15/12GK1488756SQ0315046
公开日2004年4月14日 申请日期2003年8月21日 优先权日2003年8月21日
发明者文铁桥 申请人:上海大学