专利名称：等位特异性扩增与纳米金探针结合的基因点突变检测方法
技术领域：
本发明涉及一种用于基因点突变检测和单核苷酸多态性分析的等位特异性扩增与纳米金探针结合的基因点突变检测方法。
背景技术：
目前，检测基因点突变的常用方法有限制性片段长度多态性、变性梯度凝胶电泳、化学错配裂解、酶错配裂解、单链构象多态性、等位特异性探针杂交、连接酶链式反应和竞争性寡核苷酸引物等。这些基于电泳分析的传统检测方法大多存在操作复杂、费时、需要使用放射性元素或溴化乙锭等有害物质的缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于基因点突变检测和单核苷酸多态性分析的等位特异性扩增与纳米金探针结合的基因点突变检测方法。该法操作简便、安全、快速，结果直观，无需特殊仪器，检测费用低。
本发明的等位特异性扩增与纳米金探针结合的基因点突变检测方法包括如下步骤(1)根据突变位点设计等位特异性引物，该引物的3’端碱基与突变型基因的突变碱基互补，而与野生型基因不互补。
(2)进行等位特异性扩增，突变型基因顺利扩增出双链DNA(称扩增产物1)；而野生型基因不被扩增，反应产物中含有大量未被消耗的单链DNA—引物(称扩增产物2)。
(3)向纳米金溶胶中依次加入扩增产物和电解质溶液。当加入扩增产物1时，因为纳米颗粒表面没有吸附DNA，加入电解质溶液将导致纳米金聚集，溶液颜色由红色变蓝色；而当加入扩增产物2时，单链DNA被吸附到纳米金颗粒表面，使其保持稳定，加入电解质溶液后溶液仍保持红色。
本发明是将等位特异性扩增和纳米金探针结合进行基因点突变检测，其检测基本原理如下在纳米金颗粒形成聚集的过程中，由于表面共振吸收光谱峰值的改变，其溶液颜色随聚集程度逐渐由红色变成蓝色。在纳米金溶胶中加入电解质溶液，能够引起纳米颗粒的聚集，溶胶颜色变蓝；而表面吸附了DNA的纳米金颗粒能在电解质溶液中保持稳定状态，溶液颜色不变。当纳米金分别与单、双链DNA混合后，加入电解质溶液，由于单链DNA和双链DNA与纳米金颗粒存在不同的静电作用，导致单链DNA能被吸附到纳米金颗粒表面，使得纳米金颗粒在电解质溶液中不发生聚集；而双链DNA不被吸附，纳米金颗粒在电解质溶液中发生聚集。在进行等位基因特异性扩增时，3’碱基在DNA延伸过程中起着重要作用，当引物3’末端碱基与模板互补时，DNA延伸，产生扩增产物；否则无扩增产物产生。因此，采用突变型引物对待测基因进行等位特异性扩增，突变型基因扩增产物中大部分是双链DNA；而野生型基因由于不被扩增，产物中大部分是未被消耗的单链引物。向纳米金溶胶中依次加入扩增产物和电解质溶液，单链DNA使混合液不变色，双链DNA使混合液变蓝；即以野生型基因为模板扩增的样品仍然保持红色，以突变型基因为模板扩增的样品颜色变蓝。根据野生型和突变型基因分别呈现出不同的颜色，可以直接判断待测样品的基因型。
与现有方法相比，该法具有操作简便、安全、快速，结果直观，无需特殊仪器，检测费用低等优点。
具体实施例方式
我们将等位特异性扩增与纳米金探针结合的基因点突变检测方法应用于检测K-ras基因密码子12处的突变热点，具体步骤如下(1)根据K-ras基因序列，设计突变型引物；(2)分别以野生型和突变型基因序列为模板，进行等位特异性扩增；(4)向200μl纳米金溶胶中加入10μl上述扩增产物；(5)加入60μl PBS溶液(10mM，0.2M NaCl)，观察颜色变化，用数码相机拍摄实验结果。
结果显示突变型基因颜色由红色变成蓝色；野生型基因仍然保持红色。
权利要求
1.一种等位特异性扩增与纳米金探针结合的基因点突变检测方法，其特征在于包括如下步骤(1)根据突变位点设计等位特异性引物，该引物的3’端碱基与突变型基因的突变碱基互补，而与野生型基因不互补；(2)进行等位特异性扩增，突变型基因顺利扩增出双链DNA(称扩增产物1)；野生型基因不被扩增造成反应产物中含有未被消耗的单链DNA-引物(称扩增产物2)；(3)向纳米金溶胶中依次加入扩增产物和电解质溶液，加入扩增产物1将导致溶液颜色由红色变蓝色；加入扩增产物2导致溶液仍保持红色。
全文摘要
本发明涉及一种等位特异性扩增与纳米金探针结合的基因点突变检测方法，包括根据突变位点设计等位特异性引物，该引物的3’端碱基与突变型基因的突变碱基互补，而与野生型基因不互补；进行等位特异性扩增，突变型基因顺利扩增出双链DNA(称扩增产物1)；野生型基因不被扩增造成反应产物中含有未被消耗的单链DNA－引物(称扩增产物2)；向纳米金溶胶中依次加入扩增产物和电解质溶液，加入扩增产物1将导致溶液颜色由红色变蓝色；加入扩增产物2导致溶液仍保持红色。该法检测基因点突变直观，快速，简便，实验成本低，为点突变检测及单核苷酸多态性分析提供了一种实用的新方法。
文档编号C12Q1/68GK1661094SQ200410077509
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月22日 优先权日2004年12月22日
发明者邢达, 周政, 朱德斌 申请人:华南师范大学