专利名称：基因甲基化测定对照的制作方法
背景技术：
本发明涉及甲基化基因的测定。在高等真核动物中，DNA仅在CpG二核苷酸中的位于鸟苷5’的胞嘧啶处甲基化。这种修饰对于基因表达，特别是当其涉及位于基因启动子区的富含CpG的区域(CpG岛)时有重要的调节作用。正常非甲基化的CpG岛的异常甲基化是在无限增殖化和转化细胞中频繁发生的事件，且其与某些肿瘤抑制基因或其它与某些人类癌症的改善相关的基因的转录失活相联系。
甲基化特性PCR(“MSP”)是现在已知的测定基因甲基化的技术中最好的方法之一。该方法的原理基于亚硫酸氢盐与胞嘧啶相对于与5-甲基胞嘧啶的不同反应性。胞嘧啶通过与亚硫酸氢盐反应或碱性脱磺酸基作用被转化为尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶反应明显更慢。因此，包含5-甲基胞嘧啶的基因组DNA可以被用作PCR的底物，所述PCR使用包含与5-甲基胞嘧啶相互补的鸟苷的引物。相反地，由于鸟苷对尿嘧啶(由亚硫酸氢盐反应所形成的)的杂交所形成的错配，包含胞嘧啶且所述胞嘧啶转化成尿嘧啶的基因组DNA不能被有效地引发。如此，在定量PCR之后，5-甲基胞嘧啶的存在，与在原基因组DNA中胞嘧啶的存在相比，将产生不同的Ct(周期阈)值。
胞嘧啶转化为尿嘧啶的程度对于分析的成功是重要的。理想化地，所有的胞嘧啶都如此转化。该转化依赖于DNA变性的程度，从而使变性步骤也重要了。已提出了在MSP反应的这些或其它方面和在其中使用的试剂的改进，并将持续发展。需要有一种方法来比较这些方法中规程和制剂改变的效果。同样地，需要能够确定在MSP反应中使用的试剂对质量控制或者其它目的的功效。在涉及对核酸的亚硫酸氢盐修饰的应用中，需要有能够把亚硫酸氢盐修饰步骤从评价和设计使用这样的修饰的测定中的扩增和检测方法(例如qPCR步骤)中分离出去的试剂。也需要有用于将扩增和检测方法(例如qPCR方法)标准化的试剂，所述的扩增和检测方法具体是针对不同反应条件或用于反应的引物和探针的不同所产生的效果的报道。
发明概述在本发明的一个方面，评价甲基化测定有效性的方法包括将核苷酸序列对照连接到质粒中，将质粒线性化来生成基因组核酸样品的模拟物，对该模拟物进行甲基化测定，并确定该测定的有效性。
在本发明的另一个方面，核苷酸序列对照是合成的寡核苷酸，其在已知的一个或多个位置上有甲基胞嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶。
在本发明的另一个方面，评价甲基化测定有效性的方法包括使用核苷酸序列对照，该核苷酸序列对照在已知的一个或多个位置上有甲基胞嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶。
在本发明的另一个方面，制备核苷酸序列对照的方法包括合成寡核苷酸，所述寡核苷酸在已知的有助于引发来自线性化质粒的MSP产物的一个或多个位置上有甲基胞嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶。
在本发明的另一个方面，核苷酸对照序列是合成的寡核苷酸，其在已知的有助于引发来自线性化质粒的MSP产物的一个或多个位置上有甲基胞嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶。
在本发明的另一个方面，甲基化测定的对照包括核苷酸对照序列，其为合成的寡核苷酸，所述寡核苷酸在已知的有助于引发来自线性化质粒的MSP产物的一个或多个位置上有甲基胞嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶。
在本发明的另一个方面，进行甲基化测定的试剂盒包括核苷酸对照序列。
在本发明的另一个方面，进行甲基化测定的方法包括测定核苷酸对照序列，并根据该对照序列的测定结果来确定甲基化测定是否有效。
附图简述
图1(a)为使用根据现有技术的对照的示意表示。
图1(b)为使用根据本发明方法的核苷酸序列对照的示意表示。
图2为实施例3结果的示意图。
图3为实施例3结果的示意图。
发明详述甲基化测定用于检测超甲基化的测定包括如下技术，如MSP和限制性内切核酸酶分析。
在使用本发明的对照的一个示例性测定中，使包含标记的靶细胞与结合于核酸的试剂相接触。在此处的标记是在诊断的观点来看甲基化状况具有特殊意义的核苷酸序列。也就是说，知道这样的序列是否是超甲基化的使人们能够诊断或预后诸如癌症或增生的状况。靶细胞的组分是诸如DNA或RNA的核酸。试剂可包括探针和引物，如PCR或MSP引物，或设定用于扩增和检测靶序列的其它分子。例如，试剂可包括与其自身的报道片段组合或结合的引发序列，如称为Scorpion试剂或Scorpion报道分子且在Whitcombe等的US专利6,326,145和6,270,967(以其整体在此引入作为参考)中所描述的哪些。虽然术语“引物”和“引发序列”不是精确的相同，但是它们可以在本说明书中用于指引发核酸序列扩增的分子或分子的部分。
本发明的核苷酸序列对照的最优选用途是与甲基化特性PCR反应(MSP)联合使用。也就是说，使用该对照来评价该反应的有效性，验证其操作，并提供一种对在其中使用的试剂和/或试剂盒和方法进行质量控制的手段。
在这样的MSP反应中，使含有核酸的样品与修饰未甲基化胞嘧啶的试剂进行接触；在样品中含有CpG的核酸用CpG特异性寡核苷酸引物进行扩增；以及MSP产物作为甲基化核酸存在的指示物被检测。未甲基化胞嘧啶的优选修饰是转化为能够将未甲基化胞嘧啶与甲基化胞嘧啶相区分的另一种核苷酸。优选的，该试剂将未甲基化胞嘧啶修饰为尿嘧啶，且为亚硫酸氢钠，但是，也可以使用修饰未甲基化胞嘧啶，而不修饰甲基化胞嘧啶的其它试剂。最优选亚硫酸氢钠(NaHSO3)修饰，且其易与胞嘧啶的5，6-双键反应，而难以与甲基化胞嘧啶反应。胞嘧啶与亚硫酸氢根离子反应，以生成容易脱氨基的磺酸化胞嘧啶反应中间体，从而导致生成磺酸化尿嘧啶。磺酸盐基团可以在碱性条件下被除去，从而导致了尿嘧啶的形成。尿嘧啶被Taq聚合酶识别成胸腺嘧啶，并因此在PCR后，所得产物仅在起始模板中存在5-甲基胞嘧啶的位置处包含胞嘧啶。Scorpion报道分子和试剂和其它检测系统相似地区分用这种方式处理修饰的和未修饰的种类。
在本发明中用于扩增样品中含有CpG的核酸的引物在修饰(例如，用亚硫酸氢盐修饰)后，特异性地区分未处理的DNA、甲基化的和未甲基化的DNA。在MSP中，用于未甲基化DNA的引物或引发序列优选地在3’CG对中有一个T来将其与甲基化的DNA中保持的C相区分，且为反义引物设计互补序列。用于未甲基化的DNA的MSP引物或引发序列通常在序列中包含相对少的C或G，因为在有义引物中缺乏C，而在反义引物中缺乏G(C被修饰为U(尿嘧啶)，其在扩增产物中被扩增为T(胸苷))。
甲基化过程中所用的引物是具有足够长度和适当序列的寡核苷酸，从而提供在多态的基因座处显著数目核酸聚合的特定起始。当这些序列暴露于探针或报道分子时，用引物扩增的序列揭示了甲基化的状况，并因此揭示了诊断信息。
在甲基化测定中使用的引物最优选是八个或更多个能够起始引物延伸产物的合成的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，其基本上与多态基因座链互补。有助于合成的环境条件包含三磷酸核苷和用于聚合的试剂，例如DNA聚合酶，以及合适的温度和pH的存在。引物或引发序列的引发片段为了在扩增中有最大效率优选是单链，但可以是双链。如果是双链，则在被用于制备延伸产物之前，首先处理引物来分离它的链。在用于聚合的诱导试剂存在的情况下，引物必须足够长以引发延伸产物的合成。引物的准确长度将取决于诸如温度、缓冲液和核苷酸组成的因素。优选根据已知设计方针或规则，寡核苷酸引物最优选包含大约12-20个核苷酸，尽管其可包含更多或更少的核苷酸。
设计引物来与要扩增的基因组基因座的每条链基本上互补，并且如前所述引物含有适当的G或C核苷酸。这意味着在允许用于聚合的试剂发挥功能的条件下，引物必须充分互补来与它们各自的链杂交。也就是说，引物应当与5’和3’侧翼序列具有充分的互补性来进行杂交，并允许基因组基因座的扩增。
相对于包含的反应步骤数，在甲基化测定中使用的引物产生更大量的靶基因座，最优选指数式更大量的靶基因座。一般，一个引物与基因座的负(-)链相互补，而另一个引物与正(+)链相互补。将引物与变性的核酸退火，之后用酶，例如DNA聚合酶I的大片段(Klenow)和核苷酸进行延伸，得到新合成的包含靶基因座序列的+和-链。链反应的产物是不连续的核酸双链体，其具有与使用的具体引物的末端相对应的末端。
以纯化或非纯化形式存在的任何核酸样品都可以被用作单个或多个起始核酸，前提是其包含，或者怀疑其包含含有靶基因座(例如，CpG)的具体核酸序列。因此，该方法可以使用，例如，DNA或RNA，包括信使RNA。DNA或RNA可以是单链或双链的。在RNA被用作模板的情形中，将使用逆转录模板生成DNA的最佳的酶和/或条件。另外，可以使用包含各一条链的DNA-RNA杂交体。也可以使用核酸的混合物，或者也可以使用在本文中之前的扩增反应所生成的核酸，所述扩增反应使用相同或不同的引物。要扩增的具体核酸序列，也就是，靶基因座，可以是大分子的片段，或者可以开始表现为不连续的分子，从而其具体序列构成了整个核酸。
用于检测甲基化CpG的包含核酸的样品可以来自任何来源，例如组织(特别地，前列腺组织和淋巴组织)、血液、淋巴、尿和精液，且可以使用各种技术来提取，例如Maniatis等人所描述的(Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，N.Y.，pp280，281，1982)。
如果提取的样品是不纯的，则可以在扩增前用许多试剂处理，所述的试剂可以有效打开样品的细胞、流体、组织或动物细胞膜，并暴露和/或分离核酸的链。该暴露和分离链的溶解和核酸变性步骤将使扩增更容易发生。
当样品的靶核酸序列包含两条链时，需要在其被用作模板之前分离核酸的链。链的分离既可以作为独立的步骤实现，也可以与引物延伸产物的合成同时实现。这种链的分离可以通过使用各种合适的变性条件来实现，包括物理的、化学的或酶的方式。分离核酸链的一种物理方法包括加热核酸直至其变性。一般的加热变性可以包括温度范围从大约80℃到105℃，进行最多10分钟。链的分离也可以用来自于称为解旋酶的酶类或具有解旋酶活性的酶RecA，并且在已知变性DNA的riboATP存在时诱导。Kuhn Hoffmann-Berling描述了使用解旋酶的适合于核苷酸的链分离的反应条件(CSH-Quantitative Biology，4363，1978)。C.Radding综述了使用RecA的技术(Ann.Rev.Genetics，16405-437，1982)。现在这些技术的改进也是公知的。
当单个或多个核酸的互补链被分离时，不考虑核酸原来为双链还是单链，分离的链即可用作合成另外的核酸链的模板。该合成在允许引物与模板杂交发生的条件下进行。通常合成发生在缓冲的水溶液中，优选在pH 7-9，最优选大约8。优选将摩尔过量(对于基因组核酸，引物∶模板通常为大约108∶1)的两个寡核苷酸引物加入到包含分离的模板链的缓冲液中。如果本发明的方法用于诊断应用，则可能不知道互补链的量，所以相对于互补链量的引物量不是总能肯定地确定。然而作为实际情况，当要扩增的序列包含在复杂的长链核酸链的混合物中时，加入的引物量通常相对于互补链(模板)的量是摩尔过量的。优选大的摩尔过量来提高该方法的效率。
将脱氧核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP以适当的量分开地或与引物一起加入到合成混合物中，且将产生的溶液加热到大约90-100℃，进行最多10分钟，优选1-4分钟。在该加热时间段之后，使溶液冷却至室温，其对引物杂交更优选。将适当的试剂加入到冷却的混合物中来实现引物延伸反应(“用于聚合的试剂”)，且使反应在本领域已知的条件下发生。也可以将用于聚合的试剂与其它试剂一起加入，如果其是热稳定的。该合成(或扩增)反应可以在室温下发生，最多到用于聚合的试剂不再发挥功能的温度。
用于聚合的试剂可以是发挥作用以实现引物延伸产物的合成的任何化合物或体系，优选酶。用于此目的的合适的酶包括，例如，大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4DNA聚合酶、其它可用的DNA聚合酶、聚合酶的突变蛋白、逆转录酶和其它酶，包括热稳定性酶(例如，那些在受到充分提高至导致变性的温度之后进行引物延伸的酶)。优选的试剂是Taq聚合酶。合适的酶将以适当的方式促进核苷酸的组合来形成与每个基因座核酸链相互补的引物延伸产物。通常，合成将在每个引物的3’末端起始，且沿模板链的5’方向进行，直到合成终止，从而生成不同长度的分子。但是，可能有用于聚合的试剂，其使用如上所描述的相同的方法，在5’末端起始合成，并沿另一方向进行。
也可以使用扩增的替代方法，只要在该替代方法中充分扩增甲基化的和未甲基化的基因座以进行检测。基于限制性内切核酸酶活性的测定也是检测甲基化模式的灵敏方法。该测定包括组合甲基化敏感性酶和聚合酶链反应(PCR)的使用。在用酶消化DNA之后，只有当甲基化阻止了DNA切割时，PCR才将从在限制位点侧翼的引物扩增。
优选如Mullis等人的US专利4,683,195所描述的，用特异于产物的探针或报道分子来确认扩增产物为甲基化或未甲基化的，该文献被完整引入在此作为参考。用于检测多核苷酸的探针和报道分子的领域中的进展为本领域技术人员所熟知。任选地，核酸的甲基化模式可被其它技术证实，例如限制酶消化和DNA印迹杂交。可用于检测5’CpG甲基化的甲基化敏感的限制性内切核酸酶的实例包括SmaI、SacII、EagI、MspI、HpaII、BstUI和BssHII。
在许多甲基化测定中需要确定甲基化比率。这可以通过确立获得的扩增的甲基化标记的种类的量与扩增的参考标记或扩增的未甲基化标记区域的量之间的比率来完成。这最好使用定量实时PCR来实现。超过确立的或预定的截止值或阈值的比率被认为是超甲基化的，且指示具有增殖性病症，例如癌症(在GSTP1的情形中的前列腺癌)。根据已知方法来确立截止值，其中该方法用于至少两组样品具有已知的患病状况的样品和具有已知的正常状况的样品。本发明的参考标记也可以被用作内部对照。参考标记优选为在样品的细胞中的组成型表达的基因，例如β-肌动蛋白。
本发明的方法和试剂盒可以包括多重的步骤和试剂。也就是说，同时可以测定超过一种标记。
核苷酸序列对照本发明的核苷酸序列对照是与甲基化测定中的扩增子、靶或标记相对应的寡核苷酸。它们相对应的程度部分依赖于它们将实现的目的。在将对照用于质量控制目的的实例中，所述对应性是非常接近的。在这样的应用中，最优选地为对照与靶或扩增子几乎相同。在将对照用作测定试剂盒的内部对照的实例中，对照的至少一部分与测定中实际的标记、靶或扩增子相重叠。优选地，该测定使用在独立容器中的对照。
在诸如评价对测定规程提出的修饰的应用中，对照序列不仅需要与邻近靶或扩增子的序列相似，而且要能够以相似的方式参与评价的反应。最优选对照与靶或扩增子几乎相同。
对照在对甲基化测定方案有重要意义的位置将具有5-甲基胞嘧啶、未修饰的胞嘧啶或尿嘧啶碱基。优选地，每个对照具有三个这样的碱基。优选地，它们是未标记的，且因此能在qPCR中被用作靶。它们位于对甲基化测定方案来说有重要意义的位置上，意味着它们在那些位置上的存在或不存在允许对反应过程的考察。当对照用于评价或设计测定条件或方案时，优选使用所有的三种类型的对照(即，在有重要意义的位置上有5-甲基基团的至少一种类型的对照，在有重要意义的位置上有未修饰的胞嘧啶的至少一种类型的对照，和在有重要意义的位置上有尿嘧啶的至少一种类型的对照)。
本发明的一个方面，本发明的核苷酸序列对照优选是根据分子生物学的一般方法由线性化的质粒序列所构建的。
用于构建核苷酸序列对照的质粒可以有利地包含在分子生物学领域使用的任何细菌质粒中发现的所有必需组分。例如，可以包含允许其在宿主细菌中复制的复制起点。此外，合适的质粒可以包含多克隆位点来促进用于核苷酸序列对照的靶序列的克隆。其它必需或有用的质粒组分也可以包含在用于构建核苷酸序列对照的质粒中。
可使用能在细菌中复制并且适合分子生物学操作的任何质粒。对照质粒的多克隆区可被对应于构建为用作对照的片段上的位点的限制性内切核酸酶所切割。限制酶的消化形成了线性的质粒，其接受作为对照序列的外源核酸样品。然后采用标准技术从消化反应中分离消化的对照质粒。这些技术包括，但不仅限于使用玻璃珠、各种柱基质、凝胶分离等。
然后将纯化的切割的质粒与纯化的片段混合，并使用本领域所知的标准技术来把DNA分子连接在一起。DNA连接酶被用于封闭新形成的内部对照质粒的磷酸主链。
寡核苷酸一般在固体支持物上通过亚磷酰胺方法(美国专利号4,415,732；4,973,679；4,458,066；Beaucage，S.和Iyer，R.(1992)Tetrahedron 482223-2311)来合成，其使用商业上可得到的亚磷酰胺核苷，支持物，诸如二氧化硅、可控孔度玻璃(美国专利号4,458,066)和聚苯乙烯(美国专利号5,047,524和5,262,530)和自动合成仪(Models 392，394，3948 DNA/RNA Synthesizers，AppliedBiosystems)。
在甲基化测定中使用核苷酸序列对照的方法在扩增测定中，人们一般使用正对照样品以提供检查来确保测定试剂的功能性。如果在实验孔中无信号，但在对照孔中有信号，那么人们通常推论在实验孔中无靶序列，因为来自于对照孔的结果表明测定试剂是有功能的。负对照样品提供了一种确定背景信号的方法。
在本发明的甲基化测定中，PCR反应通常在样品的修饰之后进行，例如用亚硫酸氢盐来修饰。优选平行地进行甲基化和未甲基化的种类的扩增。因此，好的对照策略应当测试修饰的种类和未修饰的种类的扩增，和优选的，应当被修饰而未被修饰的种类的扩增。
这是通过按照对于基因序列扩增来说有重要意义的位置上的特定碱基来设计三组不同的对照而实现的，所述基因序列的超甲基化具有诊断或预后的重要意义。优选地，由三个5-甲基胞嘧啶制备一个这样的对照；第二个寡核苷酸有三个胞嘧啶；而第三个寡核苷酸有三个尿嘧啶核苷酸。然后对于样品的等分试样和三种对照序列的每一个进行亚硫酸氢盐处理(或不处理来作为对照)。然后进行定量PCR，例如使用设计的与未修饰的胞嘧啶杂交的引物，并比较PCR特征。如果测定正确地发挥功能，那么具有5-甲基胞嘧啶的对照显示出最低的Ct(周期阈)值，而包含尿嘧啶的对照将显示出最高的Ct值。另外，包含胞嘧啶的质粒将显示与这两个极限值相等或者介于两者之间的Ct值，这依赖于在亚硫酸氢盐反应中使用哪个引物来考察哪个胞嘧啶(原来三种中的)和达到什么转化百分率。
评价甲基化测定的方法在本发明的一个优选和示例性的实施方案中，四种100个碱基的寡核苷酸(SEQ ID 1，SEQ ID 2，SEQ ID 3，SEQ ID 4)被用于评价基于GSTP1(SEQ ID No.7)超甲基化的甲基化测定。在此处，SEQ ID 1和3相互杂交，且SEQ ID 2和4相互杂交，以形成两个独立的双链体。SEQ ID 1代表GSTP1基因在亚硫酸氢盐修饰后的顶端链的100个碱基，(如果在鸟苷之前的所有胞嘧啶都被甲基化了)。所有剩余的胞嘧啶都被尿嘧啶取代以产生亚硫酸氢盐反应的终产物(如果100％的胞嘧啶被转化为尿嘧啶)。SEQ ID 2代表GSTP1基因在亚硫酸氢盐修饰后的顶端链的100个碱基，(如果在鸟苷之前的所有胞嘧啶都未被甲基化)。因此，在该寡核苷酸中所有的胞嘧啶都被尿嘧啶取代。SEQ ID 3代表GSTP1基因在亚硫酸氢盐修饰后的底端链的100个碱基，(如果在鸟苷之前的所有胞嘧啶都被甲基化了)。所有剩余的胞嘧啶都被尿嘧啶取代以产生亚硫酸氢盐反应的终产物(如果100％的胞嘧啶被转化为尿嘧啶)。SEQ ID 4代表GSTP1基因在亚硫酸氢盐修饰后的底端链的100个碱基，(如果在鸟苷之前的所有胞嘧啶都未被甲基化)。因此，在该寡核苷酸中所有的胞嘧啶都被尿嘧啶取代。类似地，SEQ ID 5和SEQ ID 6可以相互杂交。SEQ ID 5代表β-肌动蛋白基因在亚硫酸氢盐修饰后的顶端链的100个碱基(如果无胞嘧啶被甲基化)。所有胞嘧啶都被尿嘧啶取代以产生亚硫酸氢盐反应的终产物(如果100％的胞嘧啶被转化为尿嘧啶)。SEQ ID 6代表β-肌动蛋白基因在亚硫酸氢盐修饰后的底端链的100个碱基(如果无胞嘧啶被甲基化)。因此，在该寡核苷酸中所有的胞嘧啶都被尿嘧啶取代。
因为这些产物代表亚硫酸氢盐转化的终产物，所以这些双链体的每一个的使用仅测量了qPCR的效果。因此，这些双链体对于如下方面是有用的
1)确定在检测甲基化序列和未甲基化序列中显示最佳性能(例如，灵敏性)的条件2)确定多个试剂批次(酶混合物、探针或引物合成法等)的可再现性3)PCR反应的标准化或定量4)对于PCR用作正和负对照特别地，如上所描述的方法仅仅测量了亚硫酸氢盐反应下游的试剂和方法的效果。通过这种方式，人们可以使任何混杂的效果从不完全的或不一致的(对于一些胞嘧啶是完全的，但对于其它的是部分的)亚硫酸氢盐转化中分离出来。可以使用其它甲基化测定的对照来进行该相同的方法。实际上，其可用于其它的测定，在这样的测定中靶是在不同于其扩增和/或检测的步骤中被修饰的。
试剂盒本发明的试剂盒可以设定为具有多种组分，前提是它们都包含根据本发明的至少一种核苷酸序列对照。在一个实施方案中，试剂盒包含用于扩增和检测超甲基化的标记片段的试剂。任选地，试剂盒包含样品制备试剂和/或用来从样品中提取核酸的物品(例如，管)。
在优选的试剂盒中，包括对于一管(one-tube)MSP必需的试剂，例如，相应的PCR引物组，热稳定的DNA聚合酶，例如Taq聚合酶，和合适的检测试剂，例如水解探针或分子信标。在任选的优选试剂盒中，检测试剂是Scorption报道分子或试剂。也可使用特异于双链DNA的单染料引物或荧光染料，例如溴化乙锭。引物在量上优选是产生高浓度的。试剂盒中的其它材料可以包括合适的反应管或小瓶，障碍组合物，一般为蜡珠，任选地包括镁；必需的缓冲液和试剂，例如dNTPs；对照核酸和/或可能在MSP反应中用到的任何其它缓冲液、化合物、辅因子、离子组分、蛋白和酶、聚合物等。任选地，该试剂盒包含核酸提取试剂和材料。
实施例实施例1核苷酸序列对照的制备使用TriLink Biotechnologies(San Diego，CA)的标准亚磷酰胺化学方法来合成合成的的100个碱基的寡核苷酸。在需要的位置合成5-甲基胞苷和尿苷亚磷酰胺。用聚丙烯酰胺凝胶电泳来纯化寡核苷酸。使用分光光度法在260nm波长下测量寡核苷酸的浓度。SEQ ID 1和SEQ ID 3相互杂交，并连续稀释以用于qPCR测定中。SEQ ID 2和SEQ ID 4相互杂交，并连续稀释以用于qPCR测定中。
实施例2在MSP反应中对照的使用在25μl含有如下组分的反应物中扩增合成的对照67mM Tris pH8.8，16.6mM(NH4)2SO4，6.7mMMgCl2，10mMβ巯基乙醇；各1.25mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP，1U热启动(Hot start)Taq DNA聚合酶，250nM Scorpion探针和250nM反向或正向引物(依据Scorpion的设计)。然后在CepheidSmartCyclerPCR仪上通过定量实时PCR测定来测试样品。所用的PCR条件是95℃下60秒，然后进行95℃下30秒、59℃下30秒的40个循环，并在72℃下进行5分钟的最终延伸。在每个循环的59℃下收集光学数据。如下所示的结果证实了，Scorpion测定能够探测甲基化的GSTP1，而设计来测量未甲基化的β-肌动蛋白的β-肌动蛋白测定也能做到。该结果也证实了测定的可再现性。
实施例3使用对照来验证测定方案为了验证1)GSTP1 Scorpion测定仅能探测经亚硫酸氢盐处理之后的甲基化DNA，而不能探测未甲基化DNA，2)GSTP1 Scorpion测定是高度灵敏的测定(即，能探测到极少的拷贝数)，及3)该测定是高度线性的，我们使用寡核苷酸双链体之一的连续稀释物来作出标准曲线。结果如表1和2所示。
表1
表2 实施例4(比较的和预测的)使用最接近的现有技术来确定在甲基化特性PCR中报道分子的性能，将导致研究者不得不挑选出仅归因于报道分子的性能问题相对于归因于报道分子和/或在亚硫酸氢盐反应中不完全或部分的转化的性能。通常，实验设计(DOE)类型的研究被设计用于研究几个PCR参数(例如，缓冲液条件、酶浓度、引物和探针浓度)。但是这些实验的成功依赖于如下假设，即之前的亚硫酸氢盐转化已经成功了。
在本发明中，合成的模拟亚硫酸氢盐转化终产物的靶被用于DOE中，且因此报道只归因于后来的PCR条件的效果。
序列表<110>MAZUMDER，AbhijitVARDE，ShobhaBRIGGS，Thomas<120>基因甲基化测定对照<130>VDX5028USNP<140>not yet assigned<141>2005-10-28<160>7<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>100<212>DNA<213>人工的<220>
<223>将U合成到序列中，以作为胞嘧啶通过亚硫酸氢盐方法转变为尿嘧啶的示例。
<220>
<221>misc_feature<223>其中C*代表5-甲基C<400>1cgacguucgg ggtguagcgg ucgucggggu tggggucggc gggagtucgc gggauuutuu60agaagagcgg ucggcgucgt gautuaguau tggggcggag 100<210>2<211>100<212>DNA<213>人工的<220>
<223>将U合成到序列中，以作为胞嘧啶通过亚硫酸氢盐方法转变为尿嘧啶的示例。
<400>2ugauguuugg ggtguagugg uuguuggggu tgggguuggu gggagtuugu gggauuutuu60agaagagugg uugguguugt gautuaguau tgggguggag 100<210>3<211>100<212>DNA<213>人工的<220>
<223>将U合成到序列中，以作为胞嘧啶通过亚硫酸氢盐方法转变为尿嘧啶的示例。
<220>
<221>misc_feature<223>其中C*代表5-甲基C<400>3utucguuuua gtgutgagtu acggcgucgg ucgututtut ggagggtuuc gcggautuuc60gucgguuuua guuucggcgg ucgutguauu ucgggcgtcg 100<210>4<211>100<212>DNA<213>人工的<220>
<223>将U合成到序列中，以作为胞嘧啶通过亚硫酸氢盐方法转变为尿嘧啶的示例。
<400>4utuuguuuua gtgutgagtu augguguugg uugututtut ggagggtuuu guggautuuu60guugguuuua guuuuggugg uugutguauu uugggugtug 100<210>5<211>100<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>将U合成到序列中，以作为胞嘧啶通过亚硫酸氢盐方法转变为尿嘧啶的示例。
<400>5ggagtataua ggutggggaa gtttguuutt gugtggggtg gtgatggagg aggutuagua60agtuttutgg autgtgaauu tgtgtutguu autgtgtgut 100<210>6<211>100<212>DNA<213>人工的<220>
<223>将U合成到序列中，以作为胞嘧啶通过亚硫酸氢盐方法转变为尿嘧啶的示例。
<400>6aauauauaat aauaaauaua aattuauaat uuaaaaaaut tautaaauut uutuuatuau60uauuuuauau aaaaacaaau ttuuuuaauu tatatautuu 100<210>7<211>4260<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>misc_feature<223>＞gi|341173|gb|M24485.1|HUMGSTP1G智人(Homo sapiens)(克隆pHGST-pi)谷胱甘肽S-转移酶pi(GSTP1)基因，完整的cds<400>7aacaagagat caatatctag aataaatgga gatctgcaaa tcaacagaaa gtaggcagca60aagccaaaga aaatagccta aggcacagcc actaaaagga acgtgatcat gtcctttgca120gggacatggg tggagctgga agccgttagc ctcagcaaac tcacacagga acagaaaacc180agcgagaccg catggtctca cttataagtg ggagctgaac aatgagaaca catggtcaca240
tggcggcgat caacacacac tggtgcctgt tgagcggggt gctggggagg gagagtacca300ggaagaatag ctaagggata ctgggcttaa tacctgggtg atgggatgat ctgtacagca360aaccatcatg gcgcacacac ctatgtaaca aacctgcaca tcctgcacat gtaccccaga420acttcaaata aaagttggac ggccaggcgt ggtggctcac gcctgtaatc ccagcacttt480gggaagccga ggcgtgcaga tcacctaagg tcaggagttc gagaccagcc cggccaacat540ggtgaaaccc cgtctctact aaaaatacaa aaatcagcca gatgtggcac gcacctataa600ttccacctac tcgggaggct gaagcagaat tgcttgaacc cgagaggcgg aggttgcagt660gagccgccga gatcgcgcca ctgcactcca gcctgggcca cagcgtgaga ctacgtcata720aaataaaata aaataacaca aaataaaata aaataaaata aaataaaata aaataataaa780ataaaataaa ataaaataaa ataaaataaa ataaagcaat ttcctttcct ctaagcggcc840tccacccctc tcccctgccc tgtgaagcgg gtgtgcaagc tccgggatcg cagcggtctt900agggaatttc cccccgcgat gtcccggcgc gccagttcgc tgcgcacact tcgctgcggt960cctcttcctg ctgtctgttt actccctagg ccccgctggg gacctgggaa agagggaaag1020gcttccccgg ccagctgcgc ggcgactccg gggactccag ggcgcccctc tgcggccgac1080gcccggggtg cagcggccgc cggggctggg gccggcggga gtccgcggga ccctccagaa1140gagcggccgg cgccgtgact cagcactggg gcggagcggg gcgggaccac ccttataagg1200ctcggaggcc gcgaggcctt cgctggagtt tcgccgccgc agtcttcgcc accagtgagt1260acgcgcggcc cgctccccgg ggatggggct cagagctccc agcatggggc caacccgcag1320catcaggccc gggctcccgg cagggctcct cgcccacctc gagacccggg acgggggcct1380aggggaccca ggacgtcccc agtgccgtta gcggctttca gggggcccgg agcgcctcgg1440ggagggatgg gaccccgggg gcggggaggg ggggcaggct gcgctcaccg cgccttggca1500tcctcccccg ggctccagca aacttttctt tgttcgctgc agtgccgccc tacaccgtgg1560
tctatttccc agttcgaggt aggagcatgt gtctggcagg gaagggaggc aggggctggg1620gctgcagccc acagcccctc gcccacccgg agagatccga acccccttat ccctccgtcg1680tgtggctttt accccgggcc tccttcctgt tccccgcctc tcccgccatg cctgctcccc1740gccccagtgt tgtgtgaaat cttcggagga acctgtttac ctgttccctc cctgcactcc1800tgacccctcc ccgggttgct gcgaggcgga gtcggcccgg tccccacatc tcgtacttct1860ccctccccgc aggccgctgc gcggccctgc gcatgctgct ggcagatcag ggccagagct1920ggaaggagga ggtggtgacc gtggagacgt ggcaggaggg ctcactcaaa gcctcctgcg1980taagtgacca tgcccgggca aggggagggg gtgctgggcc ttagggggct gtgactagga2040tcgggggacg cccaagctca gtgcccctcc ctgagccatg cctcccccaa cagctatacg2100ggcagctccc caagttccag gacggagacc tcaccctgta ccagtccaat accatcctgc2160gtcacctggg ccgcaccctt ggtgagtctt gaacctccaa gtccagggca ggcatgggca2220agcctctgcc cccggagccc ttttgtttaa atcagctgcc ccgcagccct ctggagtgga2280ggaaactgag acccactgag gttacgtagt ttgcccaagg tcaagcctgg gtgcctgcaa2340tccttgccct gtgccaggct gcctcccagg tgtcaggtga gctctgagca cctgctgtgt2400ggcagtctct catccttcca cgcacatcct cttcccctcc tcccaggctg gggctcacag2460acagccccct ggttggccca tccccagtga ctgtgtgttg atcaggcgcc cagtcacgcg2520gcctgctccc ctccacccaa ccccagggct ctatgggaag gaccagcagg aggcagccct2580ggtggacatg gtgaatgacg gcgtggagga cctccgctgc aaatacatct ccctcatcta2640caccaactat gtgagcatct gcaccagggt tgggcactgg gggctgaaca aagaaagggg2700cttcttgtgc cctcaccccc cttacccctc aggtggcttg ggctgacccc ttcttgggtc2760agggtgcagg ggctgggtca gctctgggcc aggggcccag gggcctggga caagacacaa2820cctgcaccct tattgcctgg gacatcaacc agccaagtaa cgggtcatgg gggcgagtgc2880
aaggacagag acctccagca actggtggtt tctgatctcc tggggtggcg agggcttcct2940ggagtagcca gaggtggagg aggatttgtc gccagtttct ggatggaggt gctggcactt3000ttagctgagg aaaatatgca gacacagagc acatttgggg acctgggacc agttcagcag3060aggcagcgtg tgtgcgcgtg cgtgtgcgtg tgtgtgcgtg tgtgtgtgta cgcttgcatt3120tgtgtcgggt gggtaaggag atagagatgg gcgggcagta ggcccaggtc ccgaaggcct3180tgaacccact ggtttggagt ctcctaaggg caatgggggc cattgagaag tctgaacagg3240gctgtgtctg aatgtgaggt ctagaaggat cctccagaga agccagctct aaagcttttg3300caatcatctg gtgagagaac ccagcaagga tggacaggca gaatggaata gagatgagtt3360ggcagctgaa gtggacagga tttggtacta gcctggttgt ggggagcaag cagaggagaa3420tctgggactc tggtgtctgg cctggggcag acgggggtgt ctcaggggct gggagggatg3480agagtaggat gatacatggt ggtgtctggc aggaggcggg caaggatgac tatgtgaagg3540cactgcccgg gcaactgaag ccttttgaga ccctgctgtc ccagaaccag ggaggcaaga3600ccttcattgt gggagaccag gtgagcatct ggccccatgc tgttccttcc tcgccaccct3660ctgcttccag atggacacag gtgtgagcca tttgtttagc aaagcagagc agacctaggg3720gatgggctta ggccctctgc ccccaattcc tccagcctgc tcccgctggc tgagtcccta3780gcccccctgc cctgcagatc tccttcgctg actacaacct gctggacttg ctgctgatcc3840atgaggtcct agcccctggc tgcctggatg cgttccccct gctctcagca tatgtggggc3900gcctcagtgc ccggcccaag ctcaaggcct tcctggcctc ccctgagtac gtgaacctcc3960ccatcaatgg caacgggaaa cagtgagggt tggggggact ctgagcggga ggcagagttt4020gccttccttt ctccaggacc aataaaattt ctaagagagc tactatgagc actgtgtttc4080ctgggacggg gcttaggggt tctcagcctc gaggtcggtg ggagggcaga gcagaggact4140agaaaacagc tcctccagca cagtcagtgg cttcctggag ccctcagcct ggctgtgttt4200
actgaacctc acaaactaga agaggaagaa aaaaaaagag agagagaaac aaagagaaat4260
权利要求
1.一种生成核苷酸序列对照的方法，其包含a)合成包含与鸟苷相邻的5-甲基胞嘧啶或取代胞嘧啶的尿嘧啶的寡核苷酸，b)使寡核苷酸退火以形成合成的双链体，c)在测定修饰的核酸的反应条件下使用合成的双链体，及d)评价测定的性能。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸的合成是在限制酶和/或连接酶存在下进行的，以将这样的对照克隆或连接进质粒或其它DNA中。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸的合成是自动化的。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述质粒是环化的或线性的。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸序列对照用于涉及核酸修饰的测定的质量控制测试。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述质量控制测试包含试剂批次的标准化、对不同仪器测定性能的标准化、对不同形式的性能的标准化、对不同位点的性能的标准化和对测定的不同操作者的性能的标准化。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述不同形式的标准化包括使用微量滴定板、管、孔、毛细管装置、管道和柱。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述合成的寡核苷酸在长度上长于或等于100个碱基。
9.如权利要求1所述的方法，其中使用了多种双链体。
10.如权利要求1所述的方法，其中在定量PCR或在终点PCR中使用了合成的双链体。
11.如栅要求1所述的方法，其中当患者的样品被使用或当合成的双链体被用于生成用于定量目的的标准曲线时，将所述合成的双链体用作甲基化特异性PCR的正对照。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述合成的双链体不包含5-甲基胞嘧啶。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述双链体用于评价msPCR测定的特异性。
14.如权利要求1所述的方法，其中生成通常只有5-甲基胞嘧啶和尿嘧啶的所述双链体的混合物。
15.如权利要求14所述的方法，其用于评价在DNA甲基化测定中未甲基化DNA的背景。
16.如权利要求1所述的方法，其中生成两种不同类型双链体的混合物，且用其来估计或确定亚硫酸氢盐转化的程度。
17.一种组合物，其包含Seq.ID No.1-6中的一个成员。
18.一种试剂盒，其包含权利要求17所述的组合物。
19.一种用于对包含核苷酸序列对照的经修饰的核酸进行测定的试剂盒。
20.权利要求19所述的试剂盒，其包含多于一个的核苷酸对照序列。
21.权利要求20所述的试剂盒，其中所述核苷酸对照序列是针对多于一个基因提供的。
22.权利要求19所述的试剂盒，其进一步包含说明书。
23.权利要求19所述的试剂盒，其进一步包含用于扩增和检测甲基化基因存在的试剂。
24.权利要求19所述的试剂盒，其进一步包含用于扩增和检测组成型表达的基因存在的试剂。
25.一种用于测定经修饰的核酸的方法，其包含，a)将怀疑经修饰的核酸与一种试剂反应，以形成一种产物，b)扩增步骤a)的产物，c)使核苷酸序列对照处于扩增的条件，及d)检测步骤b)和c)的产物的存在。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述经修饰的核酸是一种甲基化的核酸。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述步骤a)的试剂是亚硫酸氢盐或导致存在亚硫酸氢盐的组合物。
28.如权利要求26所述的方法，其进一步包含确立甲基化比率，并确定甲基化比率是否超过了截止值。
29.权利要求1所述的方法，其用于甲基化特异性PCR。
30.一种与亚硫酸氢盐转化步骤相分离的生成亚硫酸氢盐终产物对照的方法，该对照能被用于在甲基化特异性PCR测定中使PCR条件最优化，该方法包含a)自动DNA合成100个碱基的寡核苷酸，该寡核苷酸包含与鸟苷相邻的5-甲基胞嘧啶或取代胞嘧啶的尿嘧啶，其代表完成的亚硫酸氢盐转化的终产物，b)将合成的单链寡核苷酸退火以形成合成的双链体，c)与PCR热循环条件，缓冲液，酶和报道系统，优选Scorptions，结合使用合成的双链体，以最优化甲基化特异性PCR测定。
全文摘要
提供了用于评价甲基化测定有效性的方法、组合物和试剂盒，以及甲基化测定，其包含核苷酸序列对照，和使用它们的方法。
文档编号C12P19/34GK1966727SQ20061016059
公开日2007年5月23日 申请日期2006年10月31日 优先权日2005年10月31日
发明者A·马祖姆达, S·瓦德, T·布里格斯 申请人:维里德克斯有限责任公司