专利名称：通用型基因打靶载体的构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，设计一种基因打靶载体，特别是一种用于生 产转基因动物过程中的通用型基因打耙载体的构建方法。
背景技术：
转基因动物生产研究在现代家畜育种，动物疾病模型研究及基因功能研究等领域都有重要意义。自1985年Hammer等用原核注射法生产转基因兔以 来，原核注射法一直是生产转基因动物的主要方法，但原核注射法存在只能 对胚胎发育早期细胞进行操作，整合效率低，多拷贝随机插入等问题。在原 核注射法出现的同时对胚胎干细胞进行遗传修饰的技术也发展起来，并且生 产了一些转基因动物，但大家畜的胚胎干细胞迄今尚未建系。1997年克隆 羊多莉的诞生使以体细胞为遗传操作单位的转基因动物生产成为现实。基因 工程技术结合核移植技术生产转基因动物方法已经成为生产转基因动物的 主要方法，国内外报道用这种方法已经生产了转基因牛，转基因羊等动物。 结合核移植技术生产转基因动物中，国内外学者应用了腺病毒载体法、 腺病毒相关病毒载体法、慢病毒载体法、普通质粒载体法等一系列的方法对 核移植供体细胞进行遗产操作并且已经生产出了多种转基因动物。但由于基 因表达调控本身的复杂性以及这些方法介导的外源基因在动物基因组中整 合的随机性，使得外源基因在宿主动物体内的表达水平大多停留在一个较低 水平，且个体间表达水平差异很大。基因打靶技术是一种定向改变细胞或生 物个体遗传信息的实验手段，通过外源基因与基因组基因同源重组对细胞进 行单拷贝基因定位修饰技术，因此可以克服随机整合的问题，自1987年首 次报道用基因打靶技术对小鼠ES细胞进行遗传修饰以来，迄今为止用基因
打靶方法已经生产出了多种转基因动物。基因打靶也称为基因定点同源重组，是指通过外源DNA与染色体DNA同 源序列之间的重组来改造基因组特定位点，从而改变生物遗传特性的方法。 通过基因打靶可以纠正染色体特定位点上的自发突变，恢复细胞正常的生 理功能；也可以把理想突变引入到基因组的某一位点，使之稳定地遗传下 去。基因打靶的概念是20世纪70年代初在酵母研究中发展起来的，直到 1985年Smithies等才首次报道在肿瘤细胞中实现人工打靶载体和内源P球 蛋白基因间的同源重组，1987年Smithies和Capecchi的研究小组在小鼠 胚胎干细胞实现了定位剔除，现在基因打靶技术在生命科学的多个领域都有 应用。随着基因打靶技术的发展，已经出现了多种类型的基因打靶载体，大 多基因打靶载体的构建是在Mansour等设计的一种称为正负筛选系统发展 起来的，正选基因与同源臂一起整合入基因组中通过药物筛选确定整合细 胞，负选基因用于排除随机整合的细胞进一步富积中靶细胞，正选基因一般 选择新霉素抗性基因(neo)，负选基因一般选择疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV1-tk)。基因打靶技术的关键是打靶载体的构建，已公开的专利申请中有许多基 因打靶载体的构建，但都是某个基因位点的打靶载体，不同打靶位点分别构 建基因打靶载体势必增加工作量及实验经费。基因打耙载体中的正选基因在 筛选整合进细胞的同时一起随同源臂进入基因组中，正选基因的进入必将影 响转基因动物个体的生理状况，从而影响该技术在生产中的应用。发明内容针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种通 用型基因打靶载体的构建方法。为了实现上述任务，本发明采用以下的技术解决方案 一种通用型基因打靶载体的构建方法，其特征在于，该方法选择正选基
因(neo)和两个负选基因(HSV-tkl)，其中，在正选基因(neo)的两端加入 Loxp序列，将正选基因(neo)和两个负选基因(HSV-tkl)分别连入克隆载体 pGEM隱3Z，合成含有Bsp14071， Nhel， Notl， Bsul51 (Clal)， Bstl1071， Pfl2311， Spel， Pstl， SacII等稀少酶切位点的序列，将这段序列插入正选 基因和负选基因之间，正选基因和负选基因之间的酶切位点为稀少的酶切位 点，在大多数基因上不存在这些酶切位点，从而便于不同基因作为同源臂插 入，从而构建通用型基因打靶载体。本发明的方法构建的通用型基因打靶载体，打靶载体中留有的酶切位点 可以用于克隆入大部分基因，从而可以选择大部分基因作为打耙载体的同源 臂克隆入这个载体，在打靶载体正选基因的两端加上Loxp序列便于后续工 作中去除正选基因。
图1是通用型打靶载体的构建简图；图2是载体pGT的鉴定电泳图谱；其中，标号所表示的是1为Marker3， 2为BamH I酶切pGT， 3为Sal I酶切pGT， 4为Pst I酶切pGT， 5为Nhe I和Nco I双酶切pGT， 6为PCR扩增HSV-tk;图3是HSV-tk基因的PCR扩增电泳图谱，其中，标号所表示的是1 为marker3, 2、 3均是PCR扩增HSV-tk基因。图4是鉴定载体pGT正向连接电泳图谱，其中，标号所表示的是l为 Sea I酶切pGT， 2为Nco I和Nhe I双酶切pGT， 3为Sal I酶切pGT， 4为 Pst I酶切pGT， 5为Not I酶切pGT， 6为marker3。图5是合成的多克隆位点序列及酶切位点顺序，其中，多克隆位点序列是
TTATCGATGTATACGTACGACTAGTCTGCAGCCGCGGTCTAGA 酶切位点顺序是Xba]， Sgsl， Bpul1201， Bspl4071， Nhel， EcoRl， Notl ， Loxpl， Xhol， BamHl， Sall， Loxp2， Bsul51(Clal)， Bstl1071， Pfl2311， Spel， Pstl， Sac2， Xbal。图6是鉴定载体pGN电泳图谱，其中，标号所表示的是l为marker3， 2为Xho I和Sal I双酶切PGN载体，3为Sea I单酶切载体PGN。图7是鉴定载体pAT电泳图谱，其中，标号所表示的是1为marker IV， 2为Sal I酶切载体pAT， 3为Sea I酶切载体pAT， 4为Xba I酶切载体 pAT。图8是鉴定载体pA2T电泳图谱，其中，标号所表示的是l为marker IV， 2为Sac II酶切载体pA2T， 3为Sf i I酶切载体pA2T， 4为Kpn I酶切载 体pA2T， 5为BamHl酶切载体pA2T。图9是验证Loxp序列功能电泳图谱，其中，标号所表示的是1为BamH I酶切载体pA2T2， 2为BamH I酶切载体pA2T， 3和5为PCR扩增载体pA2T， 4为PCR扩增载体pA2T2。图10是验证正负选基因有效性转染山羊成纤维细胞后各组的细胞生长 状况图，其中图为A组山羊成纤维对照组不转染载体的图片，图B为B组转 染载体后培养液中加入G418筛选组的图片，图C为C组转染载体后培养液 中加入G418和GAC筛选组的图片，图D为D组转染载体后力[]入GAC筛选组 的图片，图E为E组转染载体后正常培养组的图片，图F是F组不转染载体 加入负选药物组的图片。以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
1.材料及试剂(1)载体pORFHSV-tk(invivogen) ， pMCIneopolyA and pMCIneo (stmtagen)，
pGEM -3Z (promega) ， pGEM -T Easy (promega)，合成载体pGH (上海捷瑞公司)；(2) 菌株BM25. 8(clontech)， DH5 a (Takara)， JM109(promega);(3) 试剂各种内切酶(MBI公司)，T4DNA连接酶(Takara) ， CIAP (Takara)， Klenow (Takara)，质粒小提试剂盒(promega)，凝胶回收试剂盒(promega)， LIP0FECTAMINE2000 (Invitrogen) ， G418 (Invitrogen) ， GAC(Invivogen)， Taqmemse (Takara) ， dNTP (Takara) (4)引物(Invitrogen合成)Ptkl: GGCCGCAATAAAAATCTTTATTTTC，Ptk2: AAATGGATCTACCACATTTGTAGAGG，Pneol :CCAGGTCCACTTCGCATATTAAGGTPneo2: CGGATCCCCTCAGAAGAACTCGTCA 2.构建方法(图l)(1) . Not I ， Swa I双酶切载体pORFHSV-tk获得负选基因HSV-tk， Sma I单酶切载体pGEM-3Z，分别用0. 8%凝胶回收HSV-tk基'因和酶切pGEM-3Z， 用klenow酶补平HSV-tk后4°C'T4DNA连接酶过夜连接两片段，转化大肠杆' 菌DH5 a筛选单克隆提取质粒酶切鉴定(见图2)，得到含有一个负选基因 HSV-tk的载体pGT。(2) .设计引物Ptkl及Ptk2，以p0RFHSV-tk为模板扩增HSVl-tk基因(见 图3)， 0.8%凝胶回收？0^产物并1^^克隆入载体口0￡1 ^￡&37中，转化大肠杆 菌DH5a筛选正向连接的单克隆(见图4)，命名载体为pTK。(3) .合成一段多克隆位点序列(见图5)，这段序列的酶切位点顺序 是；Xbal， Sgsl， Bpul1201， Bspl4071， Nhel， EcoRl， Notl， Loxpl， Xhol，BamHl， Sall， Loxp2， Bsul51(Clal)， Bstl1071， Pfl2311， Spel， Pstl， Sac II， Xbal，序列上除稀少的酶切位点外还有两段34bp的回文序列 Loxp (ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT)，该序列位于载体pGH上。(4) . Xho I ， Sal I双酶切载体pMCI腦ployA得到正选基因neo， 0. 8% 凝胶回收neo基因。同时用相同的酶切载体pGH并且0. 8%凝胶回收长片段， TJ)AN连接酶连接neo基因和胶回收酶切载体pGH过夜，转化大肠杆菌DH5 a鉴定正确连接单克隆(见图6)，命名载体为pGN。(5) . Spel， SacII分别双酶切载体pTK和pGN， 0. 8。/。凝胶回收pTK中 的HSV-tk基因和pGN中的长片段，TJ)AN连接酶连接两回收片段过夜，转化 大肠杆菌DH5a鉴定正确连接单克隆(见图7)，命名载体为pAT。(6) . Xba I分别单酶切载体pGT和载体pAT， 0. 8%凝胶回收载体酶切 pGT并用CIAP去除5'端磷酸基团，凝胶回收酶切载体pAT中长片段，T,,DAN 连接酶连接两回收片段过夜，转化大肠杆菌DH5 a鉴定正确连接单克隆(见 图8)，命名载体为pA2T，载体pA2T含有一个正选基因两个负选基因。将载体pA2T转化入组成性表达Cre酶的大肠杆菌BM25. 8中验证Loxp 序列的功能，提取BM25.8中质粒命名为pA2T2，用Sac II分别酶切pA2T和 pA2T20.8。/。凝胶电泳，比较两图i普(见图9)发现pA2T2比pA2T短1100bp， 说明PA2T2中无正选基因neo。用引物Pneol及.Pneo2，分别扩增pA2T2和 pA2T并0.8。/。凝胶电泳检测，比较图谱发现pA2T2无扩增产物(见图9)，进 一步确定PA2T2中无正选基因neo，说明Loxp序列有功能，能够在打靶成 功后去除正选基因neo。将载体pA2T用LipOfeCtamineTM2000转染山羊成纤维细胞，根据正选基 因neo能分解G418使细胞免受G418毒性，负选基因HSV-tk能作用于底物 丙氧鸟苷(GAC)对正常细胞产生毒害作用的原理，检验载体pA2T中正负选 基因的有效性。设置A， B， C， D， E， F六组验证正负选基因的有效性，A
组为山羊成纤维对照组不转染载体，B组为转染载体后培养液中加入G418 (400ug/ml)筛选组，C组为转染载体后培养液中加入G418 (400ug/ml)和 GAC(4umol/L)筛选组，D组为转染载体后加入GAC (4umol/L)筛选组，E组为 转染载体后正常培养组，F组是不转染载体加负选药物GAC(4umol/L)组。转 染载体24小时后各组分别加入相应筛选药物， 一周后观察筛选结果(见图 10): A组生长正常，E组生长正常，F组生长正常，B组有部分细胞存活(G418 浓度减半(200ug/ml)后继续培养又长满)，C组细胞全部死亡，D组细胞有 部分死亡(由于转染效率的影响只有部分细胞死亡)，根据以上结果可以证 明载体中的正负选基因都有效。
权利要求
1.一种通用型基因打靶载体的构建方法，其特征在于，该方法选择正选基因(neo)和两个负选基因(HSV-tk1)，其中，在正选基因(neo)的两端加入Loxp序列，将正选基因(neo)和两个负选基因(HSV-tk1)分别连入克隆载体pGEM-3Z，合成含有Bsp14071，Nhe1，Not1，Bsu151(Cla1)，Bst11071，Pf12311，Spe1，Pst1，Sac II稀少酶切位点的序列，将这段序列插入正选基因(neo)和两个负选基因(HSV-tk1)之间，正选基因(neo)和两个负选基因(HSV-tk1)之间的酶切位点为稀少的酶切位点，从而便于不同基因作为同源臂插入。
2. 如权利要求1所述的通用型基因打靶载体的构建方法，其特征在于， 该方法具体包括下列步骤Not I ， Swa I双酶切载体pORFHSV-tk获得负选基因HSV-tk， Sma I单 酶切载体pGEM-3Z，分别0.8%凝胶回收HSV-tk基因和酶切pGEM-3Z,用 klenow酶补平HSV-tk后，4"C条件下T4DNA连接酶过夜连接两片段，转化大 肠杆菌DH5 a筛选单克隆提取质粒酶切鉴定，得到含有一个负选基因HSV-tk 的载体pGT;设计引物Ptkl及Ptk2，以pORFHSV-tk为模板扩增HSVl-tk基因，凝胶回 收？0 产物并1^^克隆入载体1^^1@-TEasy中，转化大肠杆菌DH5 a筛选正向连 接的单克隆，命名载体为pTK;合成一段多克隆位点序列，该多克隆位点序列是TTATCGATGTATACGTACGACTAGTCTGCAGCCGCGGTCTAGA; 这段序列的酶切位点顺序是Xbal， Sgsl， Bpul1201， Bspl4071， Nhel， EcoRl， Notl， Loxpl， Xhol， BamHl， Sall， Loxp2， Bsul51(Clal)， Bstl1071， Pf12311， Spel， Pstl， Sac II， Xbal，序列上除稀少的酶切位点外还有两段34bp的回文序列Loxp， 该序列位于载体pGH上；Xhol， Sal I双酶切载体pMCIneoployA得到正选基因(neo)，凝胶回 收(neo)基因，同时用相同的酶切载体pGH并且0. 8%凝胶回收长片段，LDAN 连接酶连接正选基因(neo)和胶回收酶切载体pGH过夜，转化大肠杆菌DH5 a鉴定正确连接单克隆，命名载体为pGN;Spe I ， Sac II分别双酶切载体pTK和pGN， 0, 8%凝胶回收pTK中的HSV-tk 基因和pGN中的长片段，LDAN连接酶连接两回收片段过夜，转化大肠杆菌 DH5 a鉴定正确连接单克隆，命名载体为pAT;Xba I分别单酶切载体pGT和载体pAT，凝胶回收载体酶切pGT并用CIAP 去除5'端磷酸基团，0.8。/。凝胶回收酶切载体pAT中长片段，TJ)AN连接酶 连接两回收片段过夜，鉴转化大肠杆菌DH5a定正确连接单克隆，命名载体 为pA2T，该载体pA2T含有一个正选基因(neo)和两个负选基因，即为通 用型基因打靶载体。
全文摘要
本发明公开了一种通用型基因打靶载体的构建方法，该方法选择正选基因(neo)和两个负选基因(HSV-tk1)，其中，在正选基因(neo)的两端加入Loxp序列，将正选基因(neo)和两个负选基因(HSV-tk1)分别连入克隆载体pGEM-3Z，合成含有Bsp14071，Nhe1，Not1，Bsu151(Cla1)，Bst11071，Pf12311，Spe1，Pst1，Sac II稀少酶切位点的序列，将这段序列插入正选基因(neo)和两个负选基因(HSV-tk1)之间，正选基因(neo)和两个负选基因(HSV-tk1)之间的酶切位点为稀少的酶切位点，从而便于不同基因作为同源臂插入。在基因打靶载体正选基因的两端加上Loxp序列便于后续工作中去除正选基因。
文档编号C12N15/63GK101117636SQ200710017948
公开日2008年2月6日 申请日期2007年5月29日 优先权日2007年5月29日
发明者刘凤军, 孙达权, 涌 张, 张玉玲, 陈兴启 申请人:西北农林科技大学